细菌转化：热激法

将含有目的基因的质粒导入细菌是分子生物学中的基本实验操作，常规方法有热激法和电转法两种。本期的『i实验』小编将向大家介绍用热激法将质粒导入大肠杆菌的原理。

介绍热激法之前，我们先明确几个重要的概念。

 

转化

转化是指将质粒或以其为载体构建的重组DNA 导入细菌内的过程。转化后的细菌可以获得新的遗传特性及表型。用一些特殊方法（如电击法，CaCl2等化学试剂法）处理细菌后，细胞膜的通透性会发生变化，易于外源DNA分子进入细胞。进入细胞的DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

 

我们在阅读相关的文献及科研文章时往往会涉及到另一个概念——“转染”。转染一般指将具生物功能的核酸运送到细胞内，并使之在细胞内维持其生物功能。转染的核酸可以是DNA （质粒、线性双链DNA等 ），也可以是反义寡核苷酸、RNAi（RNA interference）等。目前，基因转染技术已广泛应用于基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选等研究中。

 

感受态细胞

感受态是指受体细胞最容易接受外源DNA时的一种生理状态。感受态一般由受体菌的遗传形状所决定。但是在很大程度上，感受态也会受到外界环境的影响。处于感受态的细胞，其细胞膜的通透性大大增加，使外源DNA的可以膜表面的间隙中进入细胞。

在原核生物中，转化是一种非常常见的生命现象。在自然条件下，质粒可通过接合作用转移到新的宿主内。但是人工构建的质粒载体却无法自动完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。当我们需要将质粒载体转化细菌时，需要诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。实验室中常用的制备感受态细胞的方法包括物理方法和化学方法。化学方法通常包括CaCl₂和RbCl(KCl) 法。相比之下，虽然RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率更高，但是CaCl₂ 法简便易行，且转化效率可以满足一般实验的要求。常见的物理方法是电激法，我们将在下期介绍。

 

Cohen在1972年首次成功将质粒dna分子转化由CaCl2处理过的大肠杆菌E.coli感受态细胞。该种方法的原理是：当细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中时，细菌会在溶液中膨胀，此时细菌细胞膜的通透性会增加。转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理后，细胞会吸收DNA复合物，使其进入细胞。被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，我们即可利用选择性培养基平板进行转化子的筛选。 

 

Ca²⁺处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×10⁶~2×10⁷转化子/ug质粒DNA，此外，用其它的二价金属离子（如Mn²⁺、Co²⁺）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。 

 

制备好的感受态细菌可以加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存。但是需要注意的是，制备的感受态细胞随着冻存期的延长, 其转化效率会有所降低。

▼细菌的生长状态

• 不要使用连续传代的细胞或者处于4℃或是室温状态下的细胞，对-70℃冷冻储存的直接进行培养可以获得最高的转化效率
• 使用的细菌应处于对数生长期，其OD值一般在0.4-0.6之间，培养液的OD₆₀₀不应超过0.6

▼质粒的浓度

• 转化时不能使用高浓度的质粒，应将质粒稀释到较低浓度。否则会降低转化效率，一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％

 

▼污染

• 实验时应使用一次性塑料管及器皿来制备和储存转化所用的溶液和培养基。残留的洗涤剂会严重影响转化效率
• 操作须在无菌环境下进行，避免DNA及DNA酶的污染

▼实验操作

• 加入CaCl₂时要尽量除去培养基，以提高转化效率
• 加入CaCl₂后，操作要轻柔。此时的细胞壁较为薄脆，不能用力震荡或吹吸
• 转化过程的温度要严格按照实验要求进行控制