用NCBI进行在线PCR引物设计及验证

通常，我们在设计引物时要遵循以下3个步骤：

基因查找
引物设计
引物验证

现在，我们就以常见的肿瘤TP53基因为例来演示这一过程。

TP53是一个常见的抑癌基因，在较高比例的实体瘤患者中都发现了该基因的突变。其编码的蛋白具有调控细胞分裂、增值的功能。

首先，我们打开NCBI网站，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 选择数据库，此处我们选择“Gene”数据库，并输入要查找的基因名称（Gene Symbol）

Gene Symbol是基因的名字，每个基因的Gene Symbol是固定的，搜索时应该分辨出常用名和Gene Symbol。准确的Gene Symbol可以使我们快速地检索到目标基因。

例如，当我们输入该基因的Gene Symbol “TP53”时，页面中可以很快地显示出我们需要的结果：

而当我们输入该基因平时的常用名“p53”时，则会出现相对模糊的搜索结果：

我们在这里需要注意的是，当选择的数据库不同时，搜索结果会略有差别。例如，选择不同的数据库Gene和nucleotide时，搜索TP53的界面如下:

可以看出，当检索的数据库是nucleotide（图左）时，检索界面中的条目下面会显示“Accession”和“GI”两个信息。“Accession”和“GI”是两种不同的序列识别符，“Accession”和“GI”如同序列的身份证，当序列的数据发生改变时，它们会被赋予一个新的“Accession”和“GI”。通过“Accession”和“GI”，我们就可以在NCBI、DDBJ以及EMBL等数据库中找到该序列的相关信息。而当检索的数据库是Gene时，条目只显示Gene ID。

点击“TP53-tumor protein p53”会出现以下界面：

界面的右侧是该基因的“展示目录”，而左侧则是相对应的内容。我们点击红框条目“NCBI Reference Sequences” 即可得到该RNA的序列信息。

另外说明一下，当我们点击右侧的“Genomic regions, transcripts, and products”时可以看见，NCBI为每个基因提供了3种格式的序列，分别为Graphics 、FASTA 和GenBank

FASTA格式是一种基于文本的、用于表示核苷酸序列和氨基酸序列的格式。FASTA格式一般由“＞”开头，随后会出现一段该序列的简单注释。第二行开始是用单个字母表示的用碱基或氨基酸序列。通常，核苷酸用小写字母表示，氨基酸用大写字母表示。

相比于FASTA格式，GENEBANK格式描述的内容更多，包括该基因的发现者、相关的文章、不同mRNA及CDS的序列信息等。GENEBANK格式在列出核苷酸序列时以10个核苷酸为一组，同时在每行开端注明该段序列所在的位置，极大地方便了使用者将其与前面罗列的信息进行比对。

回到刚才的“NCBI Reference Sequences”位置，我们可以看到不同的mRNA，每个mRNA后面都有“NM”和“NP”。“NM”代表mRNA的编号，“NP”代表蛋白的编号。

在找到我们需要设计引物的目标序列后，我们就要开始为这个序列设计引物。

这里有两种便捷的方法：首先，我们可以先点击目标mRNA的“NM”号，进入界面后，再点击界面右侧的“Pick Primers”

这时，页面会变成引物设计界面：

另一种方法是，复制目标mRNA的NM号后，点击界面最下方的“Primer-BLAST”,再将NM号粘贴在“PCR-Template”框中

接下来，我们需要简单地为引物设计设定一些参数

当我们设计原核生物(如细菌、病毒等)序列的引物时，我们在“Exon/intron selection”处直接选择“No preference”；而当我们设计真核细胞中的mRNA的引物时，为了防止产物中有DNA污染，我们通常将引物设计在跨外显子处，在“Exon/intron selection”中选择“Primer must span an exon-exon junction ”。

同时，在下方高级参数设置处将引物的GC含量设置成40%-60%

最后，点击最下方的“Get Primers”，即可得到引物设计的结果。我们通常可以得到1条至多条引物，在界面上按分数高低从上至下排列。

在得到引物后，我们还需要从两个方面去检测我们所设计的引物：一是特异性，二是检查引物是否容易形成二聚体。

我们将设计好的引物填入刚才的Primer-BLAST界面，将上游引物和下游引物分别复制上去：

然后点击Primer BLAST：

BLAST后的界面会显示该引物可能会与数据库中的多少mRNA序列互补，从而提供引物特异性的信息。

检测引物的特异性后，我们还需要检测引物是否易形成二聚体。我们可以从https://sg.idtdna.com/calc/analyzer 这个网站上来检查引物的引物是否容易形成二聚体。（网站注册即可）

右侧的“SELF-DIMER”可以检测引物是否容易形成自身二聚体。首先，在序列框中输入正向引物，点击“SELF-DIMER”即可得到分析结果。一般来说，设计出的引物很难避免碱基互补，因此，当配对的碱基对数小于10时，即可认为该引物可以使用。按同样的方法，将反向引物复制粘贴到序列框中，检查反向引物自身配对的情况。