CRISPR/CAS是近年来迅速崛起的第三代基因编辑技术，目前已被广泛应用于定点剪切靶基因的相关实验中，而被精准剪切的基因又可利用同源重组修复进行一系列的基因编辑（插入荧光蛋白等）。本期的i科研，小编将向大家简单介绍CRISPR/CAS及同源重组修复技术的原理。
CRISPR/CAS是细菌用来防御噬菌体DNA注入和质粒转移的天然防御系统，CRISPR/CAS的全称是Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/ CRISPR-associated protein 9（Cas9）即“规律成簇的间隔短回文重复和CRISPR相关蛋白”。简单来说，CRISPR/CAS是一种细菌的“获得性”免疫系统，当噬菌体首次入侵时，其基因组被切割成片段后会被加入CRISPR系统的“资料库”，当噬菌体再次入侵时，CRISPR系统被再次激活，对噬菌体DNA进行精准切割。
简单来说，CRISPR/CAS系统发挥靶向切割功能分为三个阶段：
▼ 间隔序列（spacer）的获取和整合
噬菌体感染细菌时，会将自己的DNA注射进入细菌胞内。此时，细菌会将噬菌体基因序列中的一小段即前间隔序列（Protospacer）剪切下来加入到自己的CRISPR座中。新加序列总是整合到前导序列和第一个重复序列之间，这个过程由Cas1/2来完成。Cas1与Cas蛋白形成二聚体对外源DNA进行切割，并请将其整合到CRISPR座上。需要注意的是Cas1/2只能切割3’端是NGG（NCC）的片段。这个NGG序列被称为前间隔片段临近基序（protospacer adjacent motif, PAM）。不同的CRISPR系统具有不同的PAM，PAM序列对Cas蛋白发挥切割高性能是至关重要的。
▼ CRISPR序列的转录
当具有相同序列的病毒再次入侵时，CRISPR序列首先转录成CRISPR前体RNA （Pre-crRNA)，Pre-crRNA再在Cas酶的作用下，被切割成成熟的CRISPR RNA，即crRNA。此时crRNA只含有单一的间隔序列（spacer）。在II型的CRISPR系统中，该过程由Cas9和III型的RNase来协同完成。
在这切割过程中，有一个关键点需要说明：Cas蛋白与III型RNase想要完成对pre-crRNA进行切割的必要条件是CRISPR系统表达的tracrRNA (trans-activating crRNA)与pre-crRNA进行互补。tracrRNA的序列一般位于Cas基因的上游或Cas基因与CRISPR序列之间。tracrRNA可转录出2条89bp和171bp的RNA。2条tracrRNA约含有25个碱基可与Pre-CRISPR中的重复序列进行碱基互补。Cas蛋白与III型RNase对pre-crRNA进行剪切后产生了成熟的双链tracr-crRNA结构。
▼ 对靶基因的剪切
Cas9蛋白与成熟的tracr-crRNA形成复合物对靶基因进行扫描，与靶基因的前间隔序列结合后对靶基因进行剪切。
在各种内源性因素和外源性因素的共同作用下，细胞内的DNA会发生损伤，其中双链DNA的断裂(Double-strand breaks, DSBs)对细胞来说是一种极为危险的情况，细胞会对这种损伤迅速启动相应的修复机制。
近年来，随着核酸酶介导的靶向基因组编辑技术迅速发展，CR|SPR/Cas9基因编辑系统可以使基因组DNA双链发生断裂，断裂后的DNA再通过不同的修复机制来对靶基因进行编辑。
基因修复的主要途径主要包括非同源末端连接修复(Non-homologous end-joining, NHEJ)和同源重组修复(Homologous recombination, HR)两种，但是还存在有其它的非同源重组修复途径，例如微同源末端连接（MMEJ，Microhomology-mediatedendjoining)和单链退火途径(Single-strand annealing ，SSA)。其中，同源重组技术是一种重要的DNA损伤修复方式之一，也是目前实验室应用最广泛的技术。
同源重组修复主要发生在细胞周期的S和G2期，是维持基因组完整性确，保遗传信息高保真性的一种DNA修复机制。同源重组修复（homologous recombination repair, HRR）和PARP（poly(ADP-ribose)polymerase）是DNA损伤修复的两种重要机制，其中HRR参与DNA双链损伤修复，PARP负责DNA单链损伤修复。
在实际操作过程中，通常会在细胞中导入具有同源臂的模板基因，即具有与靶基因两侧相同序列的基因。断裂的双链会在模板DNA的引导下，进行DNA合成，填补缺口。一般来说，同源重组修复的活性要低于非同源末端连接(Non-homologous End Joining-NHEJ)。
同源臂的设计一般在500bp-2000bp不等，模板DNA既可以是单链DNA也可以是双链DNA。在修复的过程中，靶DNA双链的断裂处会与模板DNA的同源臂结合后从而启动同源修复。
同源重组修复是定点基因的重要工具，可利用该技术进行基因组的单碱基突变、插入绿色/红色荧光蛋白。
