qPCR引物怎么设计

今天很想介绍一下qPCR引物怎么设计，奈何家里就是打不开NCBI软件。好像最近是一直很难打开它。中美关系搞得，网站都不让上了。设计引物很简单，自己设计好，找公司合成十几块钱；如果找公司设计，那贵了去了，为了节约经费，买更重要的试剂，当然是自己设计了。

首先，打开NCBI，在gene下，输入你要设计得基因，搜索。我举个IL得例子。

搜索出来很多，选择你要的物种，一个基因有很多名字，在aliases里，留意别名。

然后点击基因再进去，一直往下拉，出现一个mRNA and protein，下面NM就是mRNA，NP就是蛋白。有的基因表达多个剪切体蛋白，会有好几条，设计mRNA引物，随便点一个NM进去。

然后出来基因名字，下面有个FASTA，点进去就是基因序列，复制序列。

然后打开另一个网站，网址是下面

进去是这样的，

paste sequence,下面有个框，把FASTA序列，复制进去。下拉，下面填写条件。

按上面的条件，填好，又上角pick primer，点击，就出来了。

出来很多条，自己要选择一下，条件主要有2个，
1.两端前5个序列，G和C含量≤3个，这样解链温度低；
2.两条引物不要位于同一个外显子区域。
如何查看外显子区域呢，下面图里这个页面往下拉有的，我的网实在打不开了。相信你会找到的。

最后，最好是BLAST一下，就是验证一下，你的引物，只扩增你要的基因。NCBI或者Pubmed，主页下面有BLAST。

点击进去,

选nucleotide BLAST,进去

把序列复制到框里，点击最下面BLAST，就好了。家里的网太差了。打开网页用了好久好久。

qPCR验证转录组结果的基因挑选原则及利用Excel制作高清大图