“ 免疫荧光技术（Immunofluorescence，IF）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。”
最近小编会陆续更新几期实验技术方面的基本介绍，和实验步骤，方便大家遗忘时查阅。这部分内容基本可以囊括大家平时使用的所有基础医学研究技术，大家一定要及时订阅关注哦。
本期介绍免疫荧光技术。相信大家对该技术已经很熟悉了吧，不妨来一起复习一下吧。
一、仪器设备
2. 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
3. 荧光显微镜
4. 玻片架
5. 滤纸
6. 37℃温箱
二、试剂
2. 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释
3. 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌 PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。
（2）对于悬浮细胞：有2种方法，
① 先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。
② 先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。
（3）对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。
（4）对于石蜡切片：免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。
2、固定（防止离体组织自溶抗原扩散）
0.5%TritonX-100室温通透20min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）
根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗，用吸水纸吸尽封闭液，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。回收一抗，加入PBST，在摇床上缓慢摇动洗涤5min，共洗涤3次。
用吸水纸吸尽洗涤液后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中孵育1h后，回收二抗，接着用PBST洗3次，每次5min；由于荧光容易淬灭，故从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都要避光。
在玻片上滴加DAPI，并注意避光孵育5min，对标本进行染核，然后用PBST洗3次，每次5min，洗去多余的DAPI。
d. 样本保存不当：注意避光;
e. 一抗不好用：建议做阳性对照确认抗体的有效性。
a. 洗涤不足：充分洗涤，适当增加洗涤次数;
c. 封闭不充分：延长时间或更换封闭液;
d. 抗体浓度过高：预实验滴定，确认最佳浓度;
e. 二抗非特异性结合：不加一抗，只加二抗，作对照;
f. 样本自发荧光：提前检测样本自发荧光情况。
b. 组织切片撕裂或有褶皱：切割刀片不太锋利，考虑重新切片;
3、阴性对照：与阳性对照相反，用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。
