“ Western blot免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。”
最近小编会陆续更新几期实验技术方面的基本介绍，和实验步骤，方便大家遗忘时查阅。这部分内容基本可以囊括大家平时使用的所有基础医学研究技术，大家一定要及时订阅关注哦。
本期介绍Western blot（免疫印记技术）。相信大家对该技术已经很熟悉了吧，不妨来一起复习一下吧。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4. 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。
5. 5%脱脂奶粉，现配：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。
（3）按1ml裂解液加10ul的PMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（4）每瓶细胞加400ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
（6）于4℃下12000rpm离心5min。
（7）将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中放于-20℃保存。
2. 组织中总蛋白的提取
（1）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
（2）加400uL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
（3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
（4）裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。
2、蛋白含量的测定
（1）从-20℃取出1mg/ml的BSA，室温融化后，备用。
（2）取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0mg，2.5mg，5.0mg，10.0mg，20.0mg，40.0mg。
（3）梯度加入各种试剂。
2. 检测样品蛋白含量
（1）取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。
（2）取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L的NaCl溶液100ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
（3）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5mL），再用无菌水洗一次。
（4）取一管考马斯亮蓝加95ml 0.15 mol/L的NaCl溶液和5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
（注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5ml样品含的蛋白量。）
2. 灌胶与上样
（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
（4）按前面方法配4%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。
（5）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
（6）测完蛋白含量后，计算含50ng蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。上样前要将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性。
（7）加足够的电泳液后开始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
3. 电泳
电泳时间一般4～5h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。整个操作在转移液中进行。
5. 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2h或40V转移3h。
2. 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。
3. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。
7、凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
四、注意事项
2. 显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。
3. DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。
