铁蛋白(FerritinH)是由重链(Fth)和轻链(Ftl)两种亚基构成球壳空腔结构,是储存铁元素的主要蛋白质,可以储存高浓度的铁,从而阻止接触产生活性氧的底物,是人体抗氧化系统的重要组成部分。
Slc7a11是胱氨酸/谷氨酸转运蛋白基因,是调控“铁超载介导铁死亡”的关键基因,也是氨基酸逆向转运体系的重要组成部分。
结论一:铁蛋白缺失(FthMCK/MCK)小鼠发生轻度心脏损伤
Figure 1
通过小鼠的全身及心脏图像(Figure 3A-B)、心体比及肺体比(Figure 3C-D)、心肌凝集素染色实验(Figure 3E-F)、心肌损伤标志物(Figure 3G-J)、心衰相关基因(Figure 3K-M)、超声心动图(Figure 3N-P)、苏木精-伊红及天狼星红染色实验(Figure 3Q)、线粒体电镜结构(Figure 3R)等实验, 作者发现给FthMCK/MCK基因敲除小鼠增加铁负荷,即高铁饮食(High-irondiet,HID),可引起左室肥厚及严重的心脏损伤。
结论三表明:高铁饮食对FthMCK/MCK基因缺陷鼠可造成严重的左室肥大及心脏损伤,心肌细胞难以抵抗高铁带来的细胞毒性,从而出现严重损伤。
Figure 3
通过转录组测序探究心肌基因表达的差异变化。高铁饮食的FthMCK/MCK小鼠近2/3的基因呈现高表达,差异显著(Figure 4A)。KEGG检索不同组小鼠心肌中富集通路的TOP10名单。铁蛋白基因敲除小鼠的心肌改变中铁死亡及谷胱甘肽代谢通路均发挥了重要作用(Figure 4B-D)。心肌损伤标志物及Slc7a11基因表达水平发生变化(Figure 4E-H)。谷胱甘肽生物合成的关键步骤及相关基因在铁死亡所发挥的作用(Figure 4I)。心肌中胱氨酸和Ptgs2(也就是前列腺素过氧化物合酶,又称环氧化酶,铁死亡的生物标志物)基因的表达水平发生变化。Slc7a11与Slc3a2基因共同编码胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白,合成谷胱甘肽,当Slc7a11基因的表达下调时,胱氨酸的摄取将显著减少(Figure 4J,K)。此外,作者对心肌组织进行丙二醛染色图像。丙二醛是铁死亡的终产物,高铁饮食的FthMCK/MCK小鼠呈现较深染色,心肌组织内丙二醇含量较高,表明脂质过氧化水平增高(Figure 4L)。由于引起铁死亡需要氧化多不饱和脂肪酸,而它们是生物活性氧脂素的前体。最后作者中展示了高铁饮食小鼠心肌中的脂质氧化及代谢物的水平(Figure 4M-U)。
结论四表明:筛选发现,铁死亡及谷胱甘肽代谢通路在Fth敲除的心肌组织中显著上调。而且心肌细胞膜上胱氨酸/谷氨酸反向转运体的功能亚基Slc7a11下调而导致的胞内胱氨酸和还原型谷胱甘肽(GSH)缺乏是诱发心肌细胞发生铁死亡的主要机制。
Figure 4
结论五:FthMyh6/Myh6小鼠给予高铁饮食后也会出现铁死亡及左室肥厚。
该步研究团队进行了包括铁蛋白基因的敲除效果(Figure 5A,B)、心脏图像(Figure 5C)、心肌损伤标志物(Figure 5D-H)、超声心动图(Figure 5I-K)、铁死亡相关标志物及ROS相关表达水平(Figure 5M-Q)等检测。
结论五表明:FthMyh6 / Myh6小鼠的表型与FthMck / Mck 小鼠基本相同,尤其是在给予高铁饮食后。
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这里主要展示了铁死亡抑制剂Fer-1对铁超载所引起的心肌损伤具有保护作用,相当于验证铁死亡是缺乏铁蛋白基因的小鼠发病的必经环节,是必要性论证,即表型的回复性实验。
研究团队进行了包括心脏图像(Figure 6A)、心体比(Figure 6B)、心肌损伤标志物及心衰相关基因的表达情况(Figure 6C-I)、HE染色及天狼星红染色(Figure 6J)、线粒体电镜结构(Figure 6K)等检测。
结论六表明:铁死亡抑制剂Fer-1的应用显著逆转了高铁饮食FthMCK/MCK小鼠的左室肥厚、心肌损伤,并且与心衰相关基因的表达水平明显降低,心肌纤维化及线粒体损伤均较未予Fer-1组减少。
Figure 6
结论七:在给予高铁饮食的FthMCK/MCK小鼠的心肌中过表达Slc7a11后,小鼠不出现铁死亡及左室肥厚
过表达Slc7a11可降低在FthMCK/MCK小鼠中的铁死亡,相当于验证Slc7a11基因是缺乏铁蛋白基因的小鼠发病的必经环节。
研究者进行了包括Slc7a11KI小鼠构建的示意图(Figure 7A),Slc7a11基因的表达水平以及心肌组织切片的tdTomato荧光图像(Figure 7B,C),心肌损伤标志物及铁死亡标志物Ptgs2表达水平(Figure 7D-K),超声心动图(Figure 7L-M)、HE染色及天狼星红染色(Figure 7O)等检测。