文章
文章用户商店文档圈子

实验技术介绍：实时荧光定量PCR

 “ 实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。”

最近小编会陆续更新几期实验技术方面的基本介绍，和实验步骤，方便大家遗忘时查阅。这部分内容基本可以囊括大家平时使用的所有基础医学研究技术，大家一定要及时订阅关注哦。

      本期介绍实时荧光定量PCR。

一、原理

       所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
二、检测方法
1. SYBRGreenⅠ法
       在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
2. TaqMan探针法
       探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

三、实验设计
1. 实验材料的处理和准备
2. 引物设计
       一般Real-Time PCR 引物的设计遵循下面一些原则：
扩增产物长度在80-150bp。
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
产物不能形成二级结构。
产物长度一般在15-30碱基之间。
GC含量在40%-60%之间。
碱基要随机分布。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物5’端可以修饰。
引物3’端不可修饰。
引物3’端要避开密码子的第3位。
三、实验操作
 

1. RNA 提取和反转录

2. Mix 配制
       由于Real-Time qPCR 灵敏度高，所以每个样品至少要做 3 个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。同学们根据所用的MasterMix、模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。
3. 样品上机
4. 数据分析
       相对于只能半定量的常规PCR而言，qPCR的优点是既可以用于判断序列的有无，即定性，也可以用于确定DNA拷贝数，即定量。
       qPCR的数据分析可以分成相对定量和绝对定量两种。比如处理组细胞与对照组细胞相比，X基因的mRNA改变了多少倍，这就是相对定量；在一定数目的细胞中，X基因的mRNA有多少个拷贝，这就是绝对定量。
       相对定量的分析结果是在相当量的实验组和对照组中一个靶基因的相对比率(倍数差异)。这种分析方法是通过等量样本间比较得到结果，需要进行归一化处理以确保相比较的两组样本具有可比性。通常我们会选择使用在各个样品中表达保持不变的基因作为参照基因(内参)，用内参的表达水平来进行归一化处理。
四、相对定量qPCR
       如果对 RNA 模板的数量不能精确定量，或者只需要知道目的基因的表达差异时，可以使用相对定量法。
       常用的相对定量数据分析方法有：双标曲线法、ΔCt法、2‐ΔΔCt法(Livak法)、用参照基因的ΔCt法和Pfaffl法。
1. 双标曲线法：每次实验都分别用标准品做内参基因和目的基因的标准曲线， 并同时扩增各待测样本中的目的基因和内参基因。然后使用标准曲线来计算待测样本中的目的基因和内参基因的表达量。最后使用如下公式得出目的基因表达差异。双标曲线法不受扩增效率差异的干扰。但是对每一个基因，每一轮实验都必须做标准曲线，而且必须有固定的标准品做标准曲线。
2. ΔCt 法：不用内参基因作为标准，实验设计简单，数据分析处理简单。需要准确量化初始材料（如细胞数目或核酸微克数），扩增效率为 100%。计算公式如下：2‐ΔCt=2‐（实验组 Ct‐对照组 Ct）
3. 2‐ΔΔCt法：这是最常用的进行相对基因表达分析的方法，得到的结果是实验组中目的基因相对于对照组中目的基因表达的差异倍数。要求目的基因和内参基因的扩增效率都接近100%，且相对偏差不超过5%。  
       计算公式如下：
首先用内参基因的Ct值对实验组(test)和对照组(con)的靶基因Ct值进行归一化：
ΔCt test=实验组目的基因Ct值-实验组内参基因Ct值
ΔCt con=实验组目的基因Ct值-实验组内参基因Ct值
随后用对照组的Ct值归一实验组的ΔCt：
ΔΔCt=ΔCt test-ΔCt con
最后计算表达水平的差异倍数：
Change Fold=2‐ΔΔCt
4. 用参照基因的ΔCt 法：这个方法的使用前提与2‐ΔΔCt法相同。计算方法如下：
对照组表达=2(对照组内参Ct‐对照组目的基因Ct)
实验组表达=2(实验组内参Ct‐实验组目的基因Ct)
这种方法得到的对照组表达水平不是1.0，但如果将得到的两个表达值都除以对照组表达值，则得到：
对照组 Ratio=1
实验组 Ratio=2(实验组内参Ct‐实验组目的基因Ct)/2(对照组内参Ct‐对照组目的基因Ct)
=2‐[(实验组目的基因Ct‐实验组内参基因Ct)‐ (对照组目的基因Ct‐对照组内参基因Ct)]
=2‐(ΔCt test‐ΔCt con)
=2‐ΔΔCt
基础实验

Western Blot内参抗体蛋白的选择原则

2020-8-13 21:38:02

基础实验

缺失心脏铁蛋白H的通过Slc7a11介导的铁死亡促进心肌病

2020-8-13 21:39:52

声明 本网站部分文章源于互联网，出于传递更多信息和学习之目的转载，并不保证内容正确或赞同其观点。
如转载稿涉及失效、版权等问题，请立即联系管理员；我们会予以修改、删除相关文章，请留言反馈。
Notice: When your legal rights are being violated, please send an email to: [email protected]
0 条回复 A文章作者 M管理员
    暂无讨论，说说你的看法吧
❯
个人中心
购物车
优惠劵
今日签到
有新私信 私信列表
搜索

  • 扫码打开当前页

返回顶部