Western Blot内参抗体蛋白的选择原则

使用蛋白质印迹法比较不同治疗组之间的蛋白质丰度时，首先需要考虑的是要找到一种方法来解决由于上样或蛋白质转移错误引起的变异。目前常用的一种方法是通过设置内参(组成型表达的蛋白)来标准化目标蛋白的相对表达。如何选择合适的内参也是一件值得注意的事情。本文通过调研历年来正式出版物的相关研究结果，对蛋白印迹的内参选择进行了全面的解读。

内参抗体种类很多，比如β-actin、β-tubunlin、GAPDH、Lamin B等，那么针对自己的实验，我们该如何选择呢？下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则：

一. 样本种属来源：

首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种？

1) 哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3等。

2) 植物来源实验样本，则可以选择plant actin、Rubisco等。

3) 其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。

二. 目的蛋白分子量：

选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin作为内参，可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。

三. 目的蛋白表达部位：

就一般的蛋白检测来说β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

以上几条原则只是针对通常情况，需要注意的问题是内参的选择还需要考虑实际的实验条件，比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，应考虑这方面因素。

我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。尤其是表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。

蛋白质印迹过程涉及多个步骤，包括样品制备，样品上样，电泳，蛋白质转膜，抗体孵育和信号检测。内参的选择和使用对蛋白印迹实验结果的可靠性起着决定性的作用。

1) 内参的上样考虑了以下几个方面的潜在变化：

2) 每个泳道中上样的蛋白质量；

3) 不同样品/泳道之间从凝胶到膜的蛋白质转移效率；

4) 抗体孵育(针对一抗或二抗)以及跨单独样本/通道的信号检测；

5) 内参对照蛋白的信号也通常用于归一化目标蛋白的信号。

为了实现内参蛋白的这些实验目的，在实验开展的时候需要让内参抗体蛋白和实验抗体蛋白在同一印迹上进行检测。

内参蛋白有多种多样的选择，对于不同特性的蛋白印迹，需要做出合适的选择，从中找到可以筛选出目标蛋白中得以稳定表达的蛋白。一般会使用组成型表达且是细胞基本功能必需的管家基因作为内参蛋白。通过查阅文献来选择实验潜在的内参蛋白是一个非常有效的办法。

吉康医学学术团队以Western blot为关键词调研了全部潜在的内参蛋白相关信息的文献。结果显示肌动蛋白(特别是β-actin)是最常用的内参对照。

一个蛋白是否能够作为内参蛋白使用需要符合这样几个标准：

1) 在测试条件下，内参蛋白质的水平保持恒定(相对于总蛋白质含量)；

内参蛋白的检测带不得干扰目标蛋白质的检测带及目标蛋白感兴趣的分子(即它们应该具有明显不同的分子量)；

2) 内参蛋白和目标蛋白的检测限在动态范围内。也就是说，实验方案和检测方法可以揭示内参蛋白和目标蛋白水平的变化，而不会出现信号饱和；

3) 内参蛋白的动态检测范围可以通过连续稀释用于蛋白质对照的蛋白质印迹法来确定。信号强度必须与将在实验中使用的蛋白浓度直接相关。

表1总结了常用的全细胞/细胞质蛋白，线粒体，核蛋白，植物组织和血清样品的上样量。

全细胞/细胞质蛋白

1) 肌动蛋白(Actin)

肌动蛋白是人类和其他脊椎动物的三类六种蛋白质家族：α1(ACTC1，心肌)，α1(ACTA1，骨骼肌)和α2(ACTA2，主动脉平滑肌) ，β(ACTB)，γ1(ACTG1)和γ2(ACTG2，肠平滑肌)。 Β和γ1是两种非肌肉肌动蛋白，它们充当微丝的主要成分。

肌动蛋白是一类高度保守的蛋白，来自人类，小鼠和鸡等多种物种的β-肌动蛋白是相同的，

人β-肌动蛋白与真菌同源蛋白具有接近90%的同一性，人β-肌动蛋白与人肌动蛋白家族的其他成员至少有93%的相似性。

肌动蛋白的这种高度保守性对于用作蛋白印迹的内参蛋白来说是非常重要的。在蛋白质印迹实验中，β和α肌动蛋白均已用作上样对照。

肌动蛋白往往在细胞中以很高的浓度存在，作为内参蛋白使用时，需要确保在动态的检测范围内工作，不会出现信号饱和，并且还可以检测到肌动蛋白水平的变化。在选择肌动蛋白作为上样参照时，应确保各对照组之间的差异很小甚至没有差异。

另外，细胞生长条件的变化会影响肌动蛋白的合成。文献资料显示，大多数情况下，β-actin在蛋白印迹分析中不是一种可靠的上样对照蛋白。

细胞生长条件的变化确实会破坏肌动蛋白的合成。出版物已经表明，在大多数情况下，β-肌动蛋白可能不是蛋白质印迹分析中可靠的上样对照。 β-肌动蛋白也作为染色质重塑复合物的组成成分存在于细胞核中，但不能用作核蛋白样品的上样对照。

2) 甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)

甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在糖酵解中能够催化无机磷酸酯和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的情况下催化3-磷酸甘油醛的可逆氧化磷酸化反应。它还具有亚硝化酶活性，并参与基因转录，RNA转运，DNA复制和凋亡。

GAPDH是一个持家基因，在Western blot和qPCR中均用作上样对照。GAPDH在物种间高度保守。它存在于细胞质，细胞核，核周区域和膜中。有研究显示GAPDH mRNA水平在不同组织类型之间存在显著差异，但在年龄和性别方面保持不变。低氧可以上调GAPDH的表达，并且GAPDH存在聚集的现象。

GAPDH的这些特性，在某些蛋白印迹分析中可以用作上样对照，但也不是所有的情况都适合。

3) 微管蛋白(Tubulins)

微管蛋白有五种类型：α，β，γ，δ和ε。 α，β和γ微管蛋白均已用作上样对照。

α微管蛋白的亚型包括1a(TUBA1A)，1b(TUBA1B)，1c(TUBA1C)，3c(TUBA3C)，3d(TUBA3D)，3e(TUBA3E)，4a(TUBA4A)和8(TUBA8)。

β微管蛋白的亚型为I类(TUBB)，IIa(TUBB2A)，IIb(TUBB2B)，III(TUBB3)，IVa(TUBB4A)，IVb(TUBB4B)，V(TUBB6)，VI(TUBB1)和VIII (TUBB8)。

γ-微管蛋白，γ1(TUBG1)和2(TUBG2)，参与微管的成核和极性取向，并存在于中心体和纺锤体中。

δ(TUBD1)和ε(TUBE1)微管蛋白倾向于定位于中心粒，是有丝分裂纺锤体的结构成分。

微管蛋白也是一种保守性很高的蛋白，微管蛋白在整个物种中都是保守的。

4) Vinculin

Vinculin是一种常用作高分子量蛋白质的上样对照蛋白。也是一种细胞骨架蛋白，它是细胞–细胞和细胞–基质连接的主要成分之一。Vinculin是一种大蛋白质，人纽蛋白的分子量为117 kDa，具有1066个氨基酸。

1) 核纤层蛋白

核纤层蛋白是核纤层蛋白的结构成分，它们支持核膜，并在细胞周期中参与核膜的分解和重新形成。在动物细胞中，三个基因编码至少七个Lamin。 LMNA基因通过交替剪接编码A和C型薄层蛋白，而LMNB1和LMNB2基因编码薄层蛋白B1和B2。每个细胞中都存在B型Lamin。胃泌乳后表达A型Lamin，而C型Lamin的表达是组织特异性的。Lamins上发生了法尼基化和磷酸化等翻译后修饰，进而调节了核纤层的组装和层粘连蛋白的活性。在Lamin中，Lamin B1最常用作加载控件。Lamin B1在整个物种中都是保守的。人Lamin B1与啮齿动物同源物具有95%的同一性，与果蝇对应物具有36%的同一性。人Lamin B1与其他人Lamin的同一性超过50%。

Lamin B1蛋白不适合作为没有核膜包被的蛋白样品的上样对照。

2) TATA盒结合蛋白

TATA盒结合蛋白TBP是一种通用转录因子，在通过RNA聚合酶II进行基因转录之前，它与TATA盒DNA序列特异性结合。TATA盒存在于10-20%的人类基因启动子中。TBP是高度保守的。人TBP与啮齿动物同源物具有约90%的同一性，而与真菌同源物具有超过60-70%的同一性。TBP的N端含有一串长的谷氨酰胺(TBP mRNA分子中的CAG重复序列)，可调节C端的DNA结合活性。在健康个体中，TBP中N末端谷氨酰胺的数量有所不同(在25到42个重复之间)，在某些病理条件下会扩展到47-63个重复。

3) 热休克蛋白

热休克蛋白(HSP)，也称为热休克认知(HSC)，是一组在某些压力下，特别是在高温下上调的蛋白。这些蛋白质具有广泛的功能，包括提供针对此类应激源的保护和陪伴细胞周围的蛋白质。某些HSP(例如HSC70和HSP90)有时用作Western印迹上样对照。

尽管某些HSP可能是组成型表达的，因此可以在某些蛋白印迹分析中用作可靠的上样对照蛋白，但切记治疗条件可能会改变某些HSP的表达，这一点至关重要。

4) 增殖细胞核抗原

增殖细胞核抗原(PCNA)与真核生物DNA复制有关。它是DNA聚合酶δ的辅因子，在细胞周期的DNA合成阶段(S阶段)期间在细胞核中表达。 PCNA在黑猩猩，狗，牛，牛，小鼠，大鼠，鸡，斑马鱼，果蝇，蚊子，粟酒裂殖酵母，酿酒酵母，乳酸克鲁维酵母，戈斯皮氏菌，格里西霉中高度保守。但是，由于PCNA的功能是在DNA复制中，因此对于非增殖细胞或经过抗增殖处理的细胞，作为上样对照蛋白不太合适。

1) VDAC1 /孔蛋白

电压依赖性阴离子通道(VDCA)是一类孔蛋白家族蛋白，是真核细胞中线粒体外膜的主要蛋白。脊椎动物中至少有三个成员(VDAC1，VDAC2和VDAC3)。VDAC1存在于线粒体外膜和质膜中，在每个位置发挥不同的功能。它在心脏，肝脏和肌肉组织中表达。由于存在可变剪接，因此存在VDAC1的多个变体。 VDAC1基因在黑猩猩，狗，牛，小鼠，大鼠，鸡和斑马鱼中是保守的。人VDAC1与小鼠同源物具有99%的同一性，与斑马鱼同源物具有85%的同一性。

2) 细胞色素C氧化酶/ COX4I1

线粒体内膜中的细胞色素C氧化酶是线粒体电子传输链的最后一个酶复合物。该复合物由线粒体和核基因编码的13个亚基组成。细胞色素C氧化酶的亚基IV具有两个同工型(同工型1和2)。它们由两个核基因(COX4I1和COX4I2)编码。亚型1在肺组织中普遍表达，而亚型2在肺组织中高度表达。 Isoform I COX4I1通常用作上样对照。人COX4I1与小鼠同源物具有80%的同一性，与其斑马鱼同源物具有63%的同一性，与人COX4I2具有60%的同一性。

1) 血清样品的转铁蛋白

转铁蛋白是血浆糖蛋白，有时用作蛋白质印迹上样对照。它的主要功能是将铁从肝脏，肠和网状内皮系统转运到整个体内的增殖细胞。具有698个氨基酸的人转铁蛋白与其小鼠同源物73%相同，与斑马鱼同源物43%相同。当考虑转铁蛋白作为上样对照时，需要考虑在某些遗传性疾病中，视黄酸会影响其表达这个影响因素。

2) APX3

APX3(抗坏血酸过氧化物酶3)已用作植物膜部分的蛋白质印迹上样对照。它是一种微粒体抗坏血酸过氧化物酶，可清除植物细胞中的过氧化氢。在拟南芥中，存在三种胞质(APX1，APX2，APX6)，两种叶绿体类型(间质sAPX，类囊体tAPX)和三种微粒体(APX3，APX4，APX5)同工型。 其他Ling Q等人将Slp1和Tic110用作拟南芥原生质体裂解物中蛋白质印迹的上样对照。

3) 其他考虑因素

也有很多文献中作者建议放弃使用蛋白质作为上样对照，而依靠蛋白质的染色之前(通过考马斯蓝)或之后在蛋白质印迹过程中的转移步骤，或使用无污点技术。将目标蛋白质的结果与总蛋白质进行比较，而不是与上样对照进行比较，从而可能导致结果的不准确。

上样对照的替代方案的问题在于，它们可能无法兼顾到理想对照的所有三个考虑因素：样品上样，蛋白质转移和抗体孵育/信号检测。

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