Western blot基本原理
Western Blot，通常我们在日常交流中说的就是简称“WB”，中文名称是“蛋白印迹”或“免疫印迹”，其核心本质是抗原抗体的特异性反应。Western Blot的基本原理是蛋白质通过凝胶电泳后，按分子量大小顺序在分离胶中分离开来，通过转膜可将胶上蛋白质转移到固相载体（通常是PVDF膜、NC膜和尼龙膜）表面，然后加入一抗去特异性结合膜上蛋白质，再加入酶或者荧光素标记的二抗，二抗与一抗结合反应后，通过底物显色、化学发光等方法检测目的蛋白。Western Blot实验一般用来判断特定蛋白在样本中是否表达及粗略分析特定蛋白表达量的高低。
Western Blot 优点
高分辨率的电泳技术
Western Blot 应用
Western Western目的蛋白的表达特性分析
目的蛋白与其它蛋白的互作
目的蛋白的组织定位
目的蛋白的表达量分析
Western Blot实验试剂及仪器
1.试剂准备
（1）甲醇
（2）转移缓冲液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g SDS 0.37g 甲醇200ml V=1L）
（3）一抗，二抗
（4）PBST，PBS，Tween-20
（5）显影液（5X）：
（6）定影液：
2. 材料准备
实验步骤
蛋白样品的制备
1.水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解 度大，是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般；
2. 有机溶剂提取法；
3. 离心管柱提取法：超快速，易用，高产及重复性强；
4. 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。
Western blot注意事项和常见问题
❶为什么检测结果有很多杂带？
❷转膜过程中的注意事项：
转膜方法可分为湿转法和半干法。需要注意：
Western blot转膜“三明治”
❸大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
| 出现问题 | 原因 |
| 条带呈笑脸状 (︶) | 凝胶不均匀冷却，中间冷却不好；迁移过快，电泳系统温度偏高。 |
| 条带呈皱眉状 (︵) | 可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者凝胶两边聚合不完全。 |
| 拖尾 | 样品溶解不好。 |
| 纹理（纵向条纹） | 样品中含有不溶性颗粒，电泳前将样品离心去除颗粒。 |
| 条带偏斜 | 电极不平衡或者加样位置偏斜。 |
| 条带两边扩散 | 加样量过多。 |
❻Western blot 结果中背景
| 可能的原因 | 建议 |
| 抗体浓度太高 | 一抗或二抗浓度太高会导致高背景，增加抗体稀释倍数。 |
| 一抗孵育的温度偏高 | 建议 4℃ 结合过夜。 |
| 使用的封闭液不兼容 | 对比不同的封闭缓冲液。 |
| 非特异性位点封闭不足 | 优化封闭缓冲液，最好的封闭缓冲液具有系统依赖性；提高封闭液中蛋白的浓度； 优化封闭时间和/或温度； 室温封闭至少 1 h 或者 4°C 封闭过夜； 在封闭液中加入 Tween-20，Tween-20 的终浓度为 0.05%。 |
| 封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应 | 换一种不同的封闭液； 不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭，牛奶含生物素； 交叉反应的检测：封闭一张干净的膜，与抗体一起孵育，然后用超感应化学发光底物检测。 |
| 缓冲液污染或结块沉淀 | 制备新的缓冲液。 |
| 洗膜不充分 | 降低 HRP 结合物的浓度； 增加洗涤次数和使用洗膜缓冲液的体积； 如果洗涤液中无 Tween-20，添加 Tween-20 使其终浓度为 0.05%。 |
| 膜在实验过程中干过 | 实验过程中要注意保持膜的湿润。 |
| 选择的膜容易产生高背景 | 一般硝酸纤维素膜（NC）的背景会比 PVDF 膜低。 |
| 膜的曝光时间过久 | 缩短印迹膜曝光到胶片的时间； 在孵育过程中始终进行震荡。 |
| 膜被污染 | 小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合；
不能空手持膜，始终带干净手套或用镊子。 |
| HRP 处产生聚集体 | 用 0.2μm 过滤器过滤结合物。 |
| 结合可产生斑点 |
用一种新的高质量的结合物。 |
| 缓冲液中有污染 | 使用新的缓冲液； 缓冲液使用前过滤。 |
| 操作设备被污染 |
保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁，无外缘污染物； 保证在转膜后没有凝胶留在膜上，蛋白可能黏在胶上导致背景。 |
❼ 条带弱
蛋白定量的意义：保证各处理组总蛋白上样量一致,蛋白总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定，蛋白含量太高会使条带扭曲，影响电泳的分辨力；
解决方案2：重新制备样品；
❽条带弯曲
原因分析2：条带向下弯曲（︵ 条带呈皱眉状）
解决方案2：制胶架装配好后，用水检查是否有空隙再灌胶。
原因分析3：条带显示不均匀，中空：可能凝固太快导致聚合不均匀；
解决方案3：使用合适的促凝剂，制胶液混合好后及时灌胶
❾ 其它问题
