文献解读:泛素化在肿瘤中的作用研究思路

蛋白质的翻译后修饰，如泛素化、磷酸化、乙酰化和糖基化，是维持真核生物中蛋白质生物学功能的重要途径。其中泛素化在许多细胞过程中起着核心作用，包括细胞增殖、凋亡、分化、DNA复制修复等。泛素-蛋白酶体系统(UPS)是蛋白质降解的主要途径，参与了80%以上的细胞内蛋白质降解。

今天我带来的就是一个泛素连接蛋白UBE2L3在肝癌细胞中影响下游蛋白稳定性而促发肿瘤表型的研究。这篇文章于2020年3月发表在Cancer Letters（IF=7.3）上, Overexpression ofubiquitin-conjugating enzyme E2L3 in hepatocellular carcinoma potentiates apoptosisevasion by inhibiting the GSK3β/p65pathway，虽然沿用了肿瘤研究中的惯用套路，但是下游作用机制做的比较透彻细致，思路也清晰明朗，所以在没有新颖的思路时，将机制做深也可以发到不错的期刊上，值得我们借鉴。

1.临床数据分析—UBE2L3在肝癌组织中表达上调，并与肝癌患者的生存相关

首先作者从NCBI数据库中发现UBE2L3的mRNA水平在肝癌（HCC）组织中显著上调，并且UBE2L3水平较高的患者总生存期明显短于对照。随后利用qPCR和WB检测了90例HCC组织和癌旁组织，结果发现UBE2L3 mRNA和蛋白在HCC组织中表达上调，免疫组化同样验证。此外，还发现高水平的UBE2L3表达与肿瘤大小和临床分级显著相关。结论：UBE2L3在HCC组织中表达上调，并与HCC患者的不良预后密切相关。

2.细胞表型研究— UBE2L3缺陷在体外和体内对HCC增殖和成瘤的抑制作用

为了研究UBE2L3对肝癌细胞增殖的影响，作者构建了UBE2L3敲除细胞系。结果显示UBE2L3基因敲除显著降低肝癌细胞的增殖能力。流式细胞仪还显示UBE2L3基因敲除显著增加了肝癌细胞的凋亡。此外，WB分析表明，UBE2L3基因敲除细胞中的凋亡标志物caspase-3和caspase-9的水平比对照细胞高。裸鼠移植实验表明，UBE2L3基因敲除组的肿瘤生长速度慢于对照组。同样，肿瘤体积和重量也更小。结论：UBE2L3缺陷抑制了肝癌细胞的增殖，促进了凋亡，抑制了肝癌的发生。

3.细胞表型研究— UBE2L3过表达促进肝癌细胞增殖

作者之后进一步分析了UBE2L3过表达对肝癌细胞增殖的影响。UBE2L3过表达显著促进了肝癌细胞的增殖、集落形成和生长。作者通过取代泛素结合所需的半胱氨酸而构建了UBE2L3突变体UBE2L3C86S。结果发现UBE2L3C86S的过表达削弱了UBE2L3在细胞中的促增殖作用，表明泛素结合酶的活性在UBE2L3调控肝癌细胞生长中起重要作用。

4.作用通路研究— UBE2L3通过调节p65信号影响肝癌细胞增殖和凋亡

作者通过KEGG分析显示，UBE2L3基因敲除影响了凋亡途径相关蛋白集，其中p65介导的促凋亡通路显著上调。qPCR验证了在UBE2L3敲除细胞中p65靶基因(PUMA、Bax、Bim、Bad和Bid)的mRNA 水平显著升高。相反，UBE2L3的过表细胞显著下调了靶基因，而UBE2L3C86S的过表达没有影响。

NF-κB是参与凋亡的重要信号可以被p65的磷酸化后激活。为了进一步验证UBE2L3对p65的作用，作者用WB检测到UBE2L3缺失显著上调 p65蛋白水平，且磷酸化增加，而UBE2L3过表达则表现出相反的作用。UBE2L3是一种泛素结合酶，作者又从UBE2L3对p65蛋白稳定性入手。用可以阻断蛋白合成的CHX处理UBE2L3过表达细胞，WB显示P65蛋白没有明显降低，CO-IP实验的结果也表明UBE2L3与p65之间不存在直接作用。表明UBE2L3不影响P65蛋白的稳定性，不直接诱导p65的下调。免疫荧光分析结果表明，在UBE2L3基因敲除细胞中，p65被移位并聚集到细胞核处。此外，双荧光素酶分析表明，UBE2L3基因敲除可增强NF-κB的荧光素酶活性，而过表达UBE2L3则起相反作用。本研究以p65下游的靶基因PUMA作为p65激活的指标。UBE2L3缺陷细胞PUMA蛋白表达水平升高，UBE2L3高表达细胞PUMA蛋白表达水平降低，而UBE2L3C86S高表达细胞PUMA蛋白表达水平无明显变化。

随后作者又使用了NF-κB抑制剂JSH-23，它可以抑制NF-κB p65核转位。结果表明，JSH-23阻断了UBE2L3基因敲除细胞中PUMA 的上调，同时JSH-23干预显著恢复了UBE2L3敲除细胞的增殖能力，也减少了由UBE2L3敲除引发的凋亡。

结论：UBE2L3通过调节NF-κB和p65信号通路促进细胞生长和抑制肝癌细胞凋亡。

5.下游作用机制研究—UBE2L3耗竭通过降低泛素化介导的GSK3β蛋白酶体降解来激活p65

GSK3β激酶被报道参与调节NF-κB活性和p65磷酸化。双荧光素酶分析表明，过表达GSK3β可提高NF-κB活性且上调p65的蛋白和磷酸化水平，而GSK3β敲除则相反。随后发现UBE2L3基因敲除或过表达均不影响GSK3β mRNA水平。UBE2L3缺失增加了GSK3β的总丰度，降低了GSK3β的磷酸化水平(失活状态)。UBE2L3过表达则结果相反，之后作者发现UBE2L3过表达细胞GSK3β蛋白的半衰期较对照细胞显著降低，表明UBE2L3影响了GSK3β蛋白的稳定性。此外，在蛋白酶体抑制剂MG132的存在下，UBE2L3过表达对GSK3β的影响被阻断，表明UBE2L3通过蛋白酶体介导的蛋白降解途径降解GSK3β蛋白。CO-IP结果显示UBE2L3与GSK3β互作，并且UBE2L3缺失显著降低了GSK3β的泛素化，而UBE2L3过表达则有相反的作用。

接下来，作者进一步研究了Gsk3β在UBE2L3致癌功能中的调控作用。GSK3β抑制剂1-azakenpaullone处理UBE2L3基因敲除细胞。结果显示，可阻断UBE2L3基因敲除引起的p65磷酸化及PUMA的上调(图7A)。同时用1-azakenpaullone处理显著挽救了UBE2L3基因敲除诱导的肝癌细胞生长抑制和凋亡促进。

结论：UBE2L3通过泛素介导的蛋白酶体降解下调了GSK3β蛋白的水平，从而导致了对p65的抑制。

6.体外动物实验— UBE2L3缺失对小鼠肝癌生长的抑制作用

为进一步验证UBE2L3的致癌功能，将UBE2L3敲除细胞、GSK3β和UBE2L3同时敲除细胞和经JSH-23处理的UBE2L3敲除细胞原位注射到裸鼠肝脏左叶。与对照组相比，UBE2L3基因敲除组的肝癌肿瘤体积明显减小。重要的是，UBE2L3基因敲除诱导的生长抑制可以通过抑制GSK3β或抑制p65来恢复。免疫组织化学分析显示，UBE2L3基因敲除组肿瘤组织中GSK3β mRNA和p65水平降低，PARP（裂解Marker）水平升高，Ki-67(增殖Marker)水平降低，这些表型可被Gsk3β敲除或p65抑制所阻断。

结论：肿瘤组织中的UBE2L3基因敲除抑制了肿瘤的生长，通过GSK3β/p65途径在体内诱导了细胞凋亡。