今天跟大家分享一篇发表在Annals of Oncology杂志（IF：18.274）的文章，主要讲的是对原发性乳腺癌样本及配对的脑转移样本的全外显子数据进行同源重组缺陷分析，发现脑转移肿瘤具有高HR缺陷评分。最后构建了基于全部外显子组测序（WES）数据的WES-HRDetect 模型，识别HR缺陷的样本。
Breast cancer brain metastases show increased levels of genomic aberration-based homologous recombination deficiency scores relative to their corresponding primary tumors
与相应的原发肿瘤相比，乳腺癌脑转移有基于基因组变异的同源重组缺陷评分增加
一、摘要
PARP抑制剂主要是利用与BRCA突变（同源重组修复的主要作用基因）联合致死，达到使DNA损伤无法修复而导致肿瘤细胞死亡的目的。由于PARP抑制剂的作用机制，PARP抑制剂有望治疗同源重组缺陷（HRD）肿瘤患者。因此，识别出有HRD增加的肿瘤患者，能够使该类治疗药物达到最佳使用。利用下一代测序数据的各种突变特征可以估计HRD水平，本工作用这种方法来确定乳腺癌脑转移显示相对于原发肿瘤的HRD评分的改变。本工作使用先前发表的21对匹配的原发性乳腺癌/脑转移对的下一代测序数据集，得出与HRD密切相关的各种突变特征/HRD得分，还对17名原发性/脑转移配对的乳腺癌患者进行了myChoice HRD分析。结果发现，在先前发表的全外显子组测序数据中，与匹配的原发肿瘤相比，脑转移中所有指示HRD的突变特征显著增加。在独立验证集中，myChoice HRD分析显示87.5%的脑转移瘤相对于原发瘤升高，根据myChoice标准，56%的脑转移瘤HRD阳性。乳腺癌脑转移瘤往往具有较高的HRD，这一一致观察可能增加脑转移瘤对PARP抑制剂治疗更敏感的可能性。同时，这一观察结果值得进一步研究，以评估这种增加是否在其他转移部位也常见，以及临床试验是否应在HRD测量应用方面调整，以确定优先接受PARP抑制剂治疗的患者。
二、数据及方法
1. 样本及数据
（1）Brastianos et al. 样本从Genotypes and Phenotypes数据库下载Brastianos et al.样本的全部外显子组测序（WES）数据，登录号为phs000730.v1.p1 。该数据集包含21例乳腺癌患者的原发性肿瘤及其相应转移肿瘤，所有原发性肿瘤均至少有一个匹配的颅内转移灶。这个乳腺癌样本集是本工作分析的基础数据。Brastianos et al. 样本没有BRCA1或BRCA2突变，然而，四份血液来源的正常样本显示，存在至少一个有害的生殖系的BRCA1或BRCA2突变。
（2）独立验证集
17例原发性乳腺癌及其脑转移的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。
2. 方法
（1）生殖系和体细胞突变
对Brastianos et al.样本数据使用 Burrows-Wheeler Aligner（BWA）序列比对算法匹配到hg19参考基因组，由原作者进行后续处理（基础重新校准）。本工作使用MuTect2识别体细胞替换以及短的插入和缺失，使用HaplotypeCaller识别生殖系BRCA1和BRCA2突变。大多数来自FFPE的样本含有突变偏倚（主要是C > T/G > A过渡），本工作使用一种类似于OxoG过滤器的方法来去除与这种FFPE-bias一致的突变。
（2）缺失（deletion）分类
将缺失分成三类：①如果在断点之后重复了单个事件的整个删除序列，则认为是重复。②如果只有前n个核苷酸在断点后重复，认为是n大小的微同源性。③如果没有以上特征，视为唯一缺失。为了消除由于微同源介导的末端连接DNA修复通路的活性而偶然出现的微同源，将其进一步分为n < 3和n≥3亚群。在本工作的预测模型中，只考虑了n≥3亚群。
（3）拷贝数分析和基因组疤痕（genomic scar）评分
对Brastianos et al.工作的全外显子组序列数据使用R包sequenza获得拷贝数数据。倍性和细胞性的范围分别被限制在[1，5]和[0.1，1]区间内，只生成常染色体的分割数据。三个基因组疤痕（已知起源的基因组畸变）的评分是用Brastianos et al.工作标准定义计算出来的。
（4）WES-HRDetect 模型
最初的HRDetect模型是根据560个乳腺癌全基因组序列的突变特征进行训练的，尽管作者创建了一个人工的全外显子组变异（将WGS限制在典型的WES基因组覆盖区域），但该计算流程的具体细节没有公布。因此，为了对本工作的WES样本使用这个预测模型，对560个人工WES数据集（包括HRD-LOH疤痕评分）重新训练LASSO逻辑回归模型。
（5）myChoice HRD分析
从FFPE组织切片中提取DNA，并按照Myriad Genetics描述的方法进行分析。简单地说，利用自定义的杂交面板生成了111个基因编码区的全基因组SNP数据和序列，产生的等位基因失衡谱用来确定三个基因组疤痕（ntAI、HRD-LOH和LST）评分。HRD总分来源于这三个独立的基因组疤痕。myChoice HRD的阈值定在42，这在之前已经用于识别HR缺陷的肿瘤。如果肿瘤样本的myChoice HRD大于42或有 BRCA1/2突变，则认为该样本HRD+，如果其myChoice HRD小于42或BRCA1/2为野生型，则认为该样本HRD-。
三、结果解析
1. 基因组疤痕-基于HRD测量
首先确定了Brastianos et al.数据集的三个基因组疤痕（ntAI、HRD-LOH和LST）评分。无论样本的突变背景如何，所有三个WES-based的评分及其总和，在脑转移中显著增加（图1）。接下来比较了接受了大脑放射治疗的患者在切除脑转移瘤之前（5/21）和没有治疗的患者的疤痕评分，发现两组之间没有显著差异，说明脑放疗没有在本工作的分析中引入偏倚。
图1. Brastianos et al. 乳腺癌脑转移样本的基因组疤痕评分
为了独立验证上述观察结果，收集了一组原发性乳腺癌和脑转移配对样本，并对其进行了myChoice HRD评分的处理和评估。17名患者中的2名（患者1和12）（图2A）有双等位基因BRCA1突变（这两例中均为有害的体细胞缺失和LOH），两例（患者4和5）显示有单等位基因BRCA2突变的迹象，但后两个突变的临床意义尚不能确定。1例（患者7）原发肿瘤的HRD评分无法确定。图2B显示，16例中有14例脑转移瘤myChoice HRD评分高于原发瘤。在四个病例中，脑转移瘤相对于原发肿瘤“改变了myChoice HRD状态”，从低myChoice HRD评分（HRD）转换到高myChoice HRD得分（HRD+）。两个BRCA1突变体的myChoice HRD评分均大于42，即两个样本均为HRD+。对myChoice HRD评分的统计比较发现，原发组和转移组之间存在显著差异（图2B），支持了Brastianos et al.数据集上的发现。还发现在两套样本集中，疤痕评分的变化与发现原发肿瘤和脑转移的时间之间的变化具有显著相关性。
图2.由Myriad Genetics对验证集进行分析
2. Brastianos et al. 数据集中体细胞的点突变特征
在本工作的特征提取过程中，21个原始样本中3个（149、244和296）和27个转移样本中有1个（296）没有通过重建步骤，因此无法确定其体细胞特征组成。其余的特征组成总结在图3A中。发现乳腺原发肿瘤的突变特征以signature 1（年龄相关特征）为主，signature 2 （APOBEC特征）、signature 3 （BRCA突变相关特征）、signature 5（另一种与年龄相关的特征）和signature 6的贡献较小。signature 3在18例脑转移患者中有13例增加。在大约20%-25%的脑转移病例中，signature 5与signature 1同样占主导地位。在单个案例（302）中，signature 17（未知相关性和生物学起源）成为转移中主要的突变特征。
3. 缺失分析
由于Brastianos et al.数据集是全外显子组测序，样本中高保真度缺失的数量很低，尽管微同源介导的缺失在转移瘤中有所增加，但两组之间的差异不显著（P < 0.13）。
4. WES-HRDetect评分
原始的HRDetect模型是使用WGS数据开发的，不能直接适用于WES数据。由于 Brastianos et al. 数据集只包含WES数据，本工作提取了可以根据可用序列（HRD-LOH、替换特征和删除类）计算的HRDLOH特征，并对其重新训练了LASSO正则化logistic回归模型。使用与原始工作相同的准则，利用WES数据开发了一个复杂的对HR缺陷的测量方法。这个WES-HRDetect模型也很好地区分了HR-缺陷（HR-deficient）和HR-正常（HR-proficient）（由BRCA突变状态确定）原发性乳腺癌。接下来计算了原发性乳腺癌脑转移配对样本的WES-HRDetect评分。与通过基因组疤痕评分获得的结果相比，这一新的测量结果显示，与原发肿瘤相比，脑转移瘤的HR-缺陷有更实质性的增加（图3B，C）。这些预测值的分布不受样本的BRCA1/2生殖系基因型或患者的放疗史的影响。将乳腺癌脑转移性WES-HRDetect评分的分布与同一模型运行的560个乳腺癌WES-HRDetect评分的分布进行比较，发现两组间存在显著差异（图3D），表明，与乳腺癌原发样本集相比，具有高WES-HRDetect评分的Brastianos et al. 脑转移样本中肿瘤显著的多。通过使用得分0.7阈值来确定原始模型，发现四个病人的转移样本从HRD-到HRD+的变化，其中两个在至少一个BRCA1/2基因中有生殖系突变。然而，一名BRCA1生殖系患者（患者222）经历了相反的变化，原始样本为HRD+，转移是HRD -。
图3.Brastianos et al. 样本的体细胞特征组成和WES-HRDetect得分
总结：本工作首先对Brastianos et al.数据集数据集的原发及转移配对样本进行分析，发现脑转移样本中基因组疤痕评分增加，接着在验证集中也发现转移样本myChoice HRD评分高。然后对 Brastianos et al. 数据集分析样本的点突变特征，识别脑转移样本中主导的特征。接下来的缺失分析显示，原发肿瘤和转移瘤的缺失无显著差异。最后基于WES数据建立识别HR缺陷的WES-HRDetect模型，也发现脑转移瘤的HR-缺陷有实质性的增加。如果您有WES或者WGS数据更要多关注咯！
