Graded-seq的概念在2019年由韩斌和黄学辉课题组提出并发表于Nature Communication（Wang et al., 2019）。这种方法与常规BSA类似的是，它也是基于性状分离群体中按照性状选择子代个体构成混池（通常加上亲本）进行测序，并进行QTL定位的方式；但与常规BSA方法仅选择两个极端性状构成子代池不同，Graded-seq通过对数量性状的中间型性状也选择子代构成混池，构成“高值组”，“中值组”，“低值组”，形成三个或三个以上的混池。其实验设计如下图所示：
既然是超过2个混池，那么常规BSA方法使用的定位算法，无论是SNP-index还是ED（欧几里得距离）都不再适用，需要使用新的算法进行关联。而Graded-seq的核心，就是Ridit检验。
Ridit是relative to an identified distribution unit一词的缩写，它是一种非参数检验分析方法，用于按等级分组资料的比较。而对于多个混池测序数据，Ridit检验会对每个位点的等位基因频率进行计算，判断其是否显著偏离标准分布，得到一个p值。换言之，这个位点的p值越小，即代表这个位点与性状相关联的可能性越高。
这听起来是不是很像GWAS关联的逻辑？对每个位点计算一个p值，并且判断是否与性状连锁。但是与GWAS不同，Ridit检验的对象只有3-4个混池，远远及不上GWAS上百个个体的基因型数据，所以Ridit检验的结果用曼哈顿图的形式展现出来，我们会发现其噪音非常强烈。如下图，我们很难从中直观地判断我们的候选区间的位置。
所以研究者们就想到了一种降噪方法，选取一定大小的窗口（根据物种不同窗口的选择也不同，论文中提到水稻的最佳窗口大小是400kb），并且将窗口内的SNP位点进行统计，计算p值低于阈值的位点所占的比例。那么经过这种滑窗计算之后，上面的图被转换成了下面这幅背景非常干净的图：
这样，就可以非常清晰地对信号进行判断了。并且由于增加了一个以上的混池，Graded-seq的定位精度通常要优于仅使用两个极端池进行的常规BSA，通常可以有数倍的提升，对于水稻等常规作物可以定位到几百kb大小的区间。如果所研究的性状是数量性状，并且有一个足够大的F2分离群体，不妨考虑一下使用Graded-seq进行定位工作，也许能够得到意想不到的惊喜。
当然了，如果得到一个足够小的区间，我们也就可以更方便地展开精细定位的工作，如何进行精细定位，我们后面会再为大家介绍。
参考文献：
Wang, C., Tang, S., Zhan, Q. et al. Dissecting a heterotic gene through GradedPool-Seq mapping informs a rice-improvement strategy. Nat Commun 10, 2982 (2019).
