详解新冠病毒的抗体及新靶标的发现

今天和大家分享的是2020年6月22日发表在Science上的一篇关于新冠病毒的中和抗体及其新靶标的文献：A neutralizing human antibody binds to the N-terminal domain of the Spike protein of SARS-CoV-2。 该研究从10名恢复期的COVID-19患者体内提取分离出单克隆抗体（mAb），三种mAb对真正的SARS-CoV-2表现出中和活性，而被命名为4A8的mAb对真正和伪型SARS-CoV-2都表现出高水平的中和活性，可作为一种潜在治疗SARS-CoV-2的候选物。利用冷冻电镜得到4A8-NTD的复合物晶体结构，发现4A8结合在SARS-CoV-2 S蛋白的NTD区域，并且两者主要通过亲水相互作用及其部分疏水、π-π相互作用结合在一起。本篇文献揭示了4A8抗体的作用机制及NTD有可能是治疗SARS-CoV-2的新靶标，为开发针对SARS-CoV-2基于结构的疫苗设计提供思路及理论基础。

研究背景

全球爆发的COVID-19已经对人类健康构成严重威胁，COVID-19由新型冠状病毒引起，即严重的急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2），伴随着咳嗽、头痛、呼吸困难、肌痛、发烧及严重的肺炎等症状的发生。

SARS-CoV-2和SARS-CoV具有80%的序列同一性，并使用相同的细胞受体—血管紧张素转化酶2（ACE2）。突刺蛋白（the Spike protein, S）三聚体修饰在冠状病毒的表面，在病毒进入细胞的过程中起关键作用。在感染过程中，S蛋白被宿主蛋白酶（如TMPRSS2）切割为N末端S1亚基和C末端S2亚基。S1由N末端区（the N-terminal domain, NTD）和受体结合区（the receptor binding domain, RBD）组成，RBD能与ACE2结合，但是NTD的功能未知。

开发设计有效中和活性的靶向SARS-CoV-2 S蛋白的单克隆抗体（mAb）是针对新型冠状病毒治疗性干预措施的重点。许多研究报告指出，针对RBD并抑制S蛋白和ACE2之间缔合的抗体的功能和结构，但是单独靶向RBD的抗体可能会使病毒产生抗药性突变。因此，寻求靶向S蛋白不同区域和靶向病毒粒子（N）蛋白的抗体成为研究的重点。

研究方法及结果

（1） 从记忆B细胞和血浆B细胞分离人源mAb

从恢复期的10名COVID-19患者中，收集血浆和外周血单核细胞。评估血浆中针对SARS-CoV-2 S蛋白不同片段（包括S-ECD、S1、S2及RBD）以及N蛋白结合抗体的效价（图1A所示），得到2号捐赠者中抗体只结合在S-ECD和S2两区域，其余9位捐赠者中抗体与SARS-CoV-2 S蛋白的每个片段都能结合。图1A、图1B结果表明自然感染SARS-CoV-2期间，10例患者都引起了体液免疫反应。为了分离S蛋白特异性mAb，利用流式细胞仪分离10名患者中的记忆B细胞和血浆B细胞，结果如图1C所示。对分离得到的B细胞进行克隆，分析克隆细胞中重链和轻链中V基因家族的分布情况以及所有克隆序列的种系的氨基酸和总核苷酸突变的数目，得到自然感染SARS-CoV-2会激发记忆B细胞高水平的细胞突变。捐赠者中抗体的互补决定区3（CDR3）长度都大致相近，但是比之前报道的抗原特异性免疫受体中的CDR3长度要长。

（2） SARS-CoV-2 S蛋白特异性人源mAb的结合图谱

为了筛选出S蛋白特异性结合抗体，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）分离确定了399种人源单克隆抗体的结合特异性。从1-5号捐赠者中分别鉴定出1、16、1、3、9种S-ECD特异性mAb。从6-10号捐赠者中鉴定出35种S-ECD特异性mAb。进一步分析上述35种mAb与S蛋白不同片段（包括S1、S2及RBD）反应特异性，根据EC50值将mAb分为4组（图2A、2B所示）。使用ELISA对几种代表性单克隆抗体进行竞争结合测定，以确定不同mAb之间是否存在重叠的抗原位点（图2C所示），结果表明自然SARS-CoV-2感染后引起的抗体应答在S蛋白的表面识别上是多样性的。为了表征基因使用和亲和力成熟的多样性，基于VHDJH和VLJL的氨基酸序列，构建了S-ECD特异性mAb的系统树（图2D所示），结果表明来自10个捐赠者的35种mAb中，VH基因的表达是多样性的，其中VH 3-30是最常用的种系基因。

（3） SARS-CoV-2 S特异性mAb中和活性

在Vero-E6细胞中使用真正的SARS-CoV-2，对35种S-ECD特异性mAb进行体外中和研究（图3A所示），得到只有三种mAb（1M-1D2、4A8、0304-3H3）能对真正的SARS-CoV-2发挥中和活性，1M-1D2、4A8、0304-3H3的EC50值分别为28、0.61、0.04μg/ml，中和活性大小为0304-3H3 > 4A8 > 1M-1D2。然而2M-10B11结合在SARS-CoV-2 RBD区的EC50是5 ng/ml（图2A所示），但是它对真正的SARS-CoV-2没有中和效果。这说明mAb对RBD的亲和力与mAb的中和能力并不完全相关。4A8和0304-3H3的抑制效果比1M-1D2明显（图2B所示）。使用HIV载体伪型SARS-CoV-2对35种S特异性mAb进行荧光素酶报告基因检测，得到三种mAb（4A8、2M10B11、9A1）能对伪型病毒发挥中和活性（图3C所示），中和活性大小为4A8 > 2M10B11 > 9A1。基于以上三方面结果，4A8对真正和伪型SARS-CoV-2能发挥出强大中和活性，因此4A8是针对SARS-CoV-2治疗性mAb的潜在候选者。

 

 

图1 分析从康复的新冠患者中分离的抗原特异性单克隆抗体

 

 

图2 S蛋白特异性单克隆抗体结合谱图

 

图3 S特异性单克隆抗体中和活性分析

 

（4） 候选单克隆抗体的结合特性

为了确定mAb可能的中和机制，利用生物层干涉法对5种具有潜在中和活性的mAb对S蛋白不同片段（包括S-ECD、S1、S2、RBD）进行结合亲和力分析（图4A所示），得到4A8与S-ECD具有高亲和力。通过流式细胞技术得到4A8不会阻断S蛋白与ACE2的结合（图4B所示）。

（5） 冷冻电镜下4A8与S-ECD复合物晶体结构

为了分析4A8与S蛋白的相互作用，使用冷冻电镜得到分辨率为3.1Å下的晶体结构（图5所示），得到S蛋白三维结构上是不对称的，三个RBD中的一个处于“向上”构象，另外两个RBD处于“向下”构象。

图4 候选单克隆抗体的结合特性

 

 

图5 4A8和S-ECD复合物的晶体结构

 

（6） 通过4A8对NTD的认识

4A8与S蛋白的复合物中，每个S蛋白三聚体都与3个已经解析的4A8片段结合，每个片段与S蛋白的一个NTD相互作用。NTD-4A8结合部分区域分辨率提高到3.3Å，从而能可靠地分析NTD与4A8之间的相互作用。在高分辨的支持下，为NTD的5个环状区域构建结构模型，得到N1（残基14-26）、N2（残基67-79）、N3（残基141-156）、N4（残基177-186）及N5（残基246-260），其中N3和N5介导与4A8的相互作用（图S5A所示）。此外，确定了NTD上三个新的糖基化位点（Asn17、Asn61、Asn149）（图S6所示）。

4A8重链主要通过3个互补决定区（CDR1（残基25-32）、CDR2（残基51-58）、CDR3（残基100-116））与NTD结合（图6A、S5B所示）。4A8与NTD接触区域由广泛的亲水性相互作用网络组成，而且该区域面积为832Å。在N5环上Arg256代表一个结合位点，该结合位点由Trp258稳定，同时与CDR1区域上的Tyr27和Glu31相互作用（图6B所示）。NTD上N3环中的Lys150与Lys147分别和4A8上的Glu54和Glu72形成盐桥（图6C所示）。Lys150和His146分别与4A8上的Tyr111和Thr30形成氢键。除了亲水相互作用，N3环上的Trp152、Tyr145与CDR3上的Val102、Pro106、Phe109通过疏水或π-π相互作用结合在一起（图6D所示）。此外，NTD上的Asn149糖基化位点靠近4A8-NTD表面，其中N-糖有可能与4A8-NTD表面产生相互作用（图6A、S6所示）。

 

图S5 NTD-4A8复合物代表性区域图

 

图 S6 S-ECD中NTD结构区域图

 

图6 NTD和4A8相互作用分析

 

总结：

1. NTD是SARS-CoV-2 S蛋白上一种新的治疗靶标。

2. 报告了一种人源单克隆抗体4A8可识别并结合到SARS-CoV-2 S蛋白上的NTD抗原表位，发挥中和活性，可作为一种潜在的治疗性mAb，其作用机制独立于受体结合机制之外。

3. 4A8与RBD靶向抗体结合可避免病毒产生抗药性突变及逃逸，并有望成为一种“鸡尾酒”疗法。