处于耐药状态的癌细胞对谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的依赖性增强，以防止脂质过氧化所诱导的细胞铁死亡（ferroptosis）[1-3]。靶向GPX4的小分子抑制剂在一系列癌症类型中实现持久的疗效。GPX4是一种含硒的磷脂过氧化酶，通过还原过氧化的脂质，保护细胞免受脂质过氧化引起的铁死亡[4]。GPX4能够减少脂质过氧化物，是已知的唯一能够完成这一关键功能的哺乳动物蛋白。GPX4的底物范围广泛，可能是由于其催化活性位点的硒代半胱氨酸（selenocysteine）附近的表面相对比较平坦。但是，由于缺乏可能的药物结合口袋，这样的结构特征也使GPX4不太容易被小分子抑制剂所靶向。现有的GPX4抑制剂都是烷化剂，通过活化的烷基氯与催化中心的硒代半胱氨酸残基共价结合。但是，这些共价抑制剂的选择性低，药代动力学性质差，开发新型的GPX4抑制剂是很有必要的。
近日，美国Broad Institute的Stuart Schreiber院士和Vasanthi Viswanathan课题组联合德国Bayer的研究者在Nature Chemical Biology发表题为Selective covalent targeting of GPX4 using masked nitrile-oxide electrophiles的研究。该研究首次揭示掩蔽的腈氧化物亲电试剂（nitrile-oxide electrophiles），可在细胞中经历化学转化后选择性靶向GPX4的活性位点。这种新型的GPX4抑制剂表现出了更高的选择性和改善的物理化学和药代动力学特性。
在该研究中，作者首先证实了新型抑制剂ML210可以在细胞水平共价抑制GPX4，引起脂质过氧化物的积累和细胞的死亡（铁死亡）。抗氧化剂ferrostatin-1则可以抑制细胞的死亡。出人意料的是，质谱分析发现，ML210并不结合提纯的GPX4蛋白。Pull-down实验发现，ML210也不结合细胞裂解物里面的GPX4，说明ML210可能需要在完整的细胞里结合和抑制GPX4（见下图）。
果然，进一步分析发现，ML210会在细胞内被转化为JKE-1674这个中间产物。用JKE-1674处理细胞，发现它也会结合GPX4，形成分子量相同的共价结合产物。JKE-1674对细胞也有类似于ML210的杀伤作用，ferrostatin-1也可以对挽救细胞的死亡，挽救的程度类似于ML210。
那么，这个中间产物JKE-1674在细胞内是怎么转变为最终的亲电试剂呢？作者最终发现JKE-1674会经历脱水，最后带有的腈氧化物基团会共价连接到GPX4的硒代半胱氨酸残基。质谱的结果表明，最后形成的共价加合物与ML210-GPX4相同。但是，具体ML210是如何在细胞内被活化的仍然不太清楚。具体什么酶参与了这个过程仍然未知。
除此之外，研究人员合成并验证了一系列类似的腈氧化物前体，都可以共价结合GPX4，形成分子量相同的加合物，并杀伤细胞。这首次说明这种掩蔽的策略可以被用于共价抑制剂的设计中，而腈氧化物亲电试剂可能对GPX4具有选择性。跟氯乙酰胺（chloroacetamide）类GPX4抑制剂相比，低浓度的ferrostatin-1即可挽救腈氧化物类抑制剂引起的细胞杀伤，说明腈氧化物类抑制剂是选择性更高的铁死亡诱导剂。全基因组的CRISPR suppressor screens也证明了这种新型抑制剂具有更高的选择性。为了了解抑制剂的药代动力学性质，实验者用LC-MS监测了抑制剂口服后24小时内在血浆的浓度，这种新型抑制剂的表现更优。
研究人员长期以来一直认为共价抑制剂的选择性较差，但这项研究提出了不一样的观点。氯乙酰胺基团常被用作共价化学探针和小分子工具，特别是可以靶向那些“不可成药”的蛋白上面的亲和残基。然而，氯乙酰胺类化合物的选择性差、生物利用度低、不稳定等缺点制约了它的发展。其他的比如丙烯酰胺等不那么强的亲电基团在特定条件下也是合适的选择，但是对于像GPX4等蛋白来说靶向的效果并不如氯乙酰胺。最后，作者希望这些工具化合物、机理分析、细胞靶点分析和生化实验能够促进学术界和药学界开发和改良抑制GPX4的小分子，以更好地理解铁死亡的生物学过程。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-020-0501-5
