文献解读:普通的代谢因子预后研究思路

今天跟大家分享的是最近发表在Frontiers in Oncology上的一篇文章，影响因子4.137。之前的也推过相似套路，一点点不一样也能发，欢迎评鉴

The Landscape of Iron Metabolism-Related and Methylated Genes in the Prognosis Prediction of Clear Cell Renal Cell Carcinoma

铁代谢相关基因和甲基化基因在肾透明细胞癌预后预测中的作用

 

首先让我们通过摘要了解一下这篇文章的主要内容，透明细胞肾细胞癌（ccRCC）对化学疗法和放射疗法具有抵抗力的特征。ccRCC的预后并不乐观，而且存在巨大的多样性。铁代谢紊乱是ccRCC中的常见现象。那么该研究的目的是通过TCGA和GEO数据库中的全面生物信息学分析，鉴定和验证与ccRCC预后不良相关的铁代谢和甲基化的候选预后基因signature。作者根据TCGA中DEGs，筛选与铁代谢相关的预后基因，使用风险评分方法建立了一个预测模型，以预测OS，计算出每位ccRCC患者的风险评分，并根据风险评分将这些患者分为两类。通过Kaplan-Meier（KM）生存率和ROC曲线分析进一步评估了hub基因的预后意义。进行单变量和多变量Cox回归分析以评估每个变量对OS的影响。作者使用来自GEO数据库的独立ccRCC队列验证了25个基因signature的预测能力。使用GSEA分析了hub相关癌基因的特征。最后，作者利用WGCNA来研究基于这些DEG的共表达网络。结果显示，作者鉴定并验证了25个与铁代谢相关的基因和甲基化的基因作为预后的特征，可以将ccRCC患者分为高风险和低风险亚组。KM分析表明，高危患者的生存率明显低于低危患者。用25个基因特征计算的风险评分可在很大程度上预测ccRCC患者1年、3年和5年的OS和DFS。其工作流程如图1。

图1.流程图

 

一.材料和方法

1.1数据源

作者从MSigDB数据库中提取了16种与铁代谢相关的基因集。去除重叠基因后，铁代谢相关基因集共包含506个基因。

 

1.2患者数据

作者从TCGA中下载ccRCC的RNA测序，临床信息和DNA甲基化数据。将533名患者随机分配到训练集（n = 350）和验证集（n = 183）。从GEO中下载了ccRCC的一套数据集，GSE22541，其包含24位患者的临床信息和相应的基因表达数据。

 

1.3 识别hub基因

作者首先从训练集中筛选了候选预后基因。 在TCGA数据库中仅筛选出409个与铁代谢相关的基因。应用350个 ccRCC样本来鉴定训练集中与预后相关的基因。应用p<0.05和FC>0.5识别ccRCC生存时间<1年的患者和生存时间超过3年的患者之间的DEG，并绘制了火山图。然后，作者检测了不同基因位点中CpG位点的甲基化状态。为了筛选与预后相关的基因，使用R中的survival包进行单变量Cox比例风险回归。

 

1.4风险评分体系的建立

多基因风险评分是一种用于评估个体患病风险的方法。鉴于选定的hub基因，为ccRCC患者建立了风险评分系统。根据所选基因表达水平（exp）乘以从单变量cox回归模型得出的回归系数（β）的线性组合来构建预后风险评分。公式如下：

基于此公式，计算出每位ccRCC患者的风险评分。根据中位风险评分，将患者分为高危和低危组。

 

1.5统计分析

进行KM曲线分析，并对低风险和高风险组患者进行Log-rank检验。应用ROC分析来评估该风险评分模型对ccRCC患者的预后准确性。

 

1.6多变量COX分析和分层分析

在训练、验证和GSE22541数据集中，应用多变量Cox比例风险回归分析来评估DEGs是否可以作为患者生存的独立预后因素。采用分层分析法，分析高危组与低危组临床因素的差异。

 

1.7 GSEA

GSEA是一种基因集富集分析方法，为了阐明25-hub基因表达与肿瘤相关基因特征的关系，利用GSEA进行富集分析。

 

1.8加权基因共表达网络分析

为了探索hub基因的调控网络，作者使用R包WGCNA对hub基因进行了评估，并创建hub基因及其模块成员的共表达网络，并使用Cytoscape3.6.1可视化网络的特征。

 

二.结果展示

2.1识别hub基因

为了通过基因表达和甲基化分析找到ccRCC进展中的重要基因，首先，作者使用TCGA数据库中的训练集研究了生存时间少于1年和3年以上的患者之间的差异表达基因。根据DEG的选择标准| logFC | > 0.5，FDR <0.05，共识别到两组之间有79个基因（下调35个，上调44个）差异表达。图2显示了上调和下调的DEG的火山图。

图2. 火山图描述了下调和上调DEGs的分布

 

随后，作者比较了这些患者中基因启动子的DNA甲基化水平。从TCGA数据库下载ccRCC患者的450K甲基化数据，以获得表达和甲基化谱。然后，在通过Z评分法将所有数据标准化后，分析了79个DEG的基因表达与CpG位点甲基化之间的相关性。结果，获得了25个差异表达的基因。然后，作者对训练集中的25个DEG进行了单变量Cox回归分析。在P <0.05的阈值下，作者发现这25个DEG被认为是与生存相关的基因，可能对ccRCC具有重要的预后价值，称为hub基因。表1显示了这25个hub基因的信息。

 表1. 通过基因表达和甲基化分析筛选出25个基因

 

2.2预后风险评分系统的构建与评估

为了全面研究这25个基因与ccRCC的预后之间的关系，基于基因表达水平和Cox计算了25个基因的生存风险评分系统。在预后模型中，每位ccRCC患者均根据中值风险评分分为高风险和低风险组。计算每个患者的预后风险评分并将其绘制在图3A中。此外，还介绍了训练和验证集中的生存时间分布（图3B）和hub基因表达水平的相应热图（图3C）。

 图3. 风险评分分布，患者生存时间分析，hub基因的热图和Kaplan-Meier分析

 

2.3  Hub基因的诊断价值

为了进一步评估低风险和高风险评分组对预后的综合影响，作者对OS进行了KM曲线分析（图3D）。在训练集中，高危评分组的患者生存率明显低于低危评分组。验证集中，低风险组的患者的OS时间比高风险组的患者明显更长。此外，在训练集中的1年，3年和5年OS中，这25个基因的signature分别实现了0.7700198、0.7248618和0.7595699的ROC值（图4）。

 图4. 基于3个数据集的风险评分，ROC曲线分析

 

同样地，这25个基因的特征可以在很大程度上预测ccRCC患者的1年，3年和5年OS，在验证集中，AUC下的面积分别为0.7539926、0.7049583和0.6488136。这些结果表明，用于预测ccRCC患者预后的25个基因signature是可靠的。

 

2.4 使用独立队列进一步验证25个基因的signature

在这里，为了验证这25个基因的signature在预测ccRCC患者预后中的可靠性，作者使用了来自GEO数据库中的一个独立ccRCC队列进行了进一步验证。在25个DEG中，GSE22541数据集中只有21个DEG。KM生存分析显示，与低风险组相比，高风险评分的ccRCC患者的DFS明显短（图3）。在该独立队列中，AUC下的面积分别为0.8359375，0.8359375和0.7342657，这表明21基因signature对于跨数据集和平台进行DFS预测是可靠且有效的（图4）。

 

2.5 hub基因的多元Cox回归分析

为了确定hub基因是否可能是与ccRCC患者预后不良相关的独立变量，作者在TCGA和GEO队列中均使用了多变量Cox回归模型。作者采用多变量Cox比例回归分析，为了证明在训练和验证集中，25个基因风险分类可作为ccRCC患者OS的独立和可靠的决定因素。其中包含的变量如表2。

表2. 对ccRCC患者进行多因素Cox回归分析

 

随后，还在GSE22541数据集中进行了多变量Cox回归，证实了21基因signature是ccRCC患者的独立预测预后指标。相关分析显示，高危和低危组的四个临床因素（组织学分级，病理学T，病理学M，病理分期）有显著差异（表3）。

 表3. 高/低风险组的分层分析结果

 

2.6 GSEA

为了阐明hub基因表达对ccRCC表达谱的潜在影响。使用GSEA软件对基因本体生物学过程进行了富集分析。GSEA对合并数据集的分析表明更高的风险评分富集到调控SANSOM_WNT_PATHWAY_REQUIRE_MYC SCIAN_CELL_CYCLE_TARGETS_OF_TP53_AND_TP73_DN和AMUNDSON_GAMMA_RADIATION_RESPONSE的基因（图5）。结果表明，铁代谢相关信号的高风险评分癌细胞可能与细胞周期阶段密切相关。上述结果表明组合数据能够反映癌症样本的表达谱和生物学特性。

图5.GSEA分析

 

2.7 WGCNA

为了探索25个hub基因的协同基因模块，作者使用R中的WGCNA包检查了共表达的基因。作者共发现119个靶基因与这些hub基因在共表达网络中共表达。图6中显示了这25个基因的共表达网络。

图6. 25个基因signature的共表达网络

好啦，这篇文章的内容就这么多啦~对代谢感兴趣的小伙伴往下看哦