文献解读:ceRNA结合免疫

虽然研究不同类型的肿瘤，但在分析过程中都遵循一定的研究套路，并在不同程度上都可以模仿与参考的。因此，小编选取了其中一篇给大家讲解下这类型的文章是如何着手与分析的。

主要思路是首先通过TCGA数据库下载复发软组织肉瘤和原发性肿瘤的miRNA，lncRNA及mRNA数据与对应临床信息，利用R语言求出差异性基因和构建ceRNA网络。通过生存预后分析得出LPP-AS2，MUC1,GAB2，hsa-let-7i-5p，hsa-let-7f-5p，hsa-miR-101-3p，hsa-miR-1226-3p七种潜在生物标志物。其次利用CIBERSORT算法分析肿瘤中的免疫细胞组成，并通过生存预后分析，与基因相关性分析构建出多变量模型。最后通过体外实验，多维数据库对结果进行验证。

软组织肉瘤（STS）是一种罕见的恶性肿瘤，四肢、脏器、腹膜和躯干是最常见的部位，占所有病例的70%。手术切除是治疗STS常见的医疗手段，但由于解剖部位限制，局部复发率高。即使在根治性手术后，约30%的患者在10年内仍会出现局部复发(LR)。因此，迫切需要探讨STS复发的潜在机制，以提供潜在的预后因素和治疗方案。

研究发现，肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞都参与了肿瘤发生发展，并证实了其种类和比例与生存预后相关。并且肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞通常受到内源性RNA (ceRNA)网络的调控，这些内源性RNA网络由信使RNA (mRNAs)、长链非编码RNA (lncRNAs)和microRNAs (miRNAs)组成。然而，到目前为止，还没有定义联合网络来预测STS复发的生存预后。因此，联合肿瘤浸润免疫细胞和ceRNA网络构建多变量模型对早期预测复发STS的生存预后具有重要意义。

作者先从TCGA下载数据得到14447lncRNAs，2558miRNAs，19660mRNAs。以|logFC| > 1和FDR < 0.5标准筛选出差异基因，并绘制出对应的热图和火山图（图1）。

图1 A 差异表达基因的热图；B 差异表达基因的火山图；C 差异lncRNA的火山图；D 差异miRNA的火山图；E 差异表达基因的组成

将23个基因其中包括11个lncRNA-miRNA关系对，12个miRNA-mRNA关系对组成ceRNA网络图。

接下来通过绘制KM曲线和COX回归探究网络中的生物标志物与生存预后的关系。结果表明LPP-AS2，MUC1,GAB2，hsa-let-7i-5p，hsa-let-7f-5p，hsa-miR-101-3p，hsa-miR-1226-3p的表达量均与生存预后显著相关并构成新的多变量模型（图2，表1）。

表1 COX回归模型结果

 图3 Lasso回归分析与ROC曲线结果

利用CIBERSORT算法分析肿瘤中的免疫细胞组成。局部复发组织中NK细胞激活比例始终低于原发肉瘤，而局部复发组织中树突细胞静息和肥大细胞静息比例较高。

然后使用Wilcoxon秩和检验评估比例差异的显著性。结果显示，树突状细胞静息(P=0.016)和NK细胞激活(P = 0.036)的比例在复发组织中均存在显著差异（图4）。

 图4 免疫细胞的组成与对应的热图，小提琴图

首先对所有免疫细胞比例进行COX回归分析，发现NK细胞激活（P=0.029），树突状细胞静止（P=0.013），肥大细胞静止（P<0.001），肥大细胞激活（P= 0.030）和巨噬细胞M1（P=0.024）是与生存预后显著相关的（表2）。

同时进行Lasso回归分析和构建ROC曲线，结果显示三年生存率的AUC值为0.709，五年生存率AUC值为0.773。最后，将免疫细胞和生物标志物纳入到模型中构建ROC曲线，结果显示三年生存率的AUC值为0.789，五年生存率AUC值为0.822，表明此多变量模型对生存预后的估计有良好的预测能力和准确性（图5）。

 表2 免疫细胞COX回归模型结果

 图5 Lasso回归分析和ROC曲线结果

此外，进一步计算免疫细胞的比例和ceRNA网络中的关键生物标志物之间的相关性，结果显示hsa-miR-1226-3p表达量与树突细胞静止显著相关（图6）。

图6 免疫细胞和ceRNA网络中的关键生物标志物相关性结果

在原发性和复发性平滑肌肉瘤（LMS）和脂肪肉瘤（LPS）标本上检测MUC1和CD11c的表达情况。结果发现在复发性LMS与LPS中显两种基因表达量均显著上调，且通过免疫组化同样也可以看到相同结果（图7）。

 图7 MUC1和CD11c的表达检测结果

在多个数据集如Oncomine，CCLE，cBioPortal，GTEx,UCSC Treehouse，The Human Protein Atlas中验证了MUC1和CD11c的表达，我们同样可以发现在癌症中MUC1显著上调（表3）。

 表3 多维数据验证结果

这篇文章到这里就结束啦！文章的创新主要在于将套路非常成熟的ceRNA网络构建与免疫免疫浸润结合起来，并加上了实验样本的检验和外部多维数据的验证，增加了数据的说服力与科学性。

总的来说难度不大，最重要理清思路和运用对应的方法，从多维度对题目进行阐述。下面流程图是小编从这几篇同类型的文章中提炼的套路，大家可以在基础上变化研究的肿瘤方向，改变ceRNA网络构建如circRNA-miRNA-mRNA。如果时间不足，还可以删掉后面的基因表达量检测，增加外部数据库验证或者横向的分析如富集分析，PPI网络等，构成一篇纯生信文章，成为进入生信大门的敲门砖了！

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