文献解读:miRNA上下游机制研究

今天小编带来的一篇文章主要研究了miRNA在胃癌中的调控分子作用，并重点阐释了与其相结合的上游及下游分子，形成一个分子轴发挥作用。虽然这篇文章只有3.8分，但适合初学者学习。不妨来看一下它miRNA上下游机制探索思路和研究方法吧。

1.miR-5100促进胃癌细胞凋亡并抑制自噬

首先作者发现miR-5100在胃癌组织和胃癌细胞系中均是低表。同时通过一系列的细胞实验证实：miR-5100具有促进胃癌细胞凋亡和抑制胃癌细胞自噬的作用。这些实验实验具体包括：Wb检测到在抑制了miR-5100后，细胞凋亡减少，流式也验证上述结果。同时在AGS细胞系中验证了miR-5100 Minic促进细胞凋亡。同时发现在MGC80-3细胞抑制了miR-5100后，自噬活性增强（LC3BII/I上调）且自噬小体含量增加。而在AGS细胞系中miR-5100 Minic降低自噬活性和自噬小体的数量。

2.CAAP1抑制胃癌细胞凋亡并促进自噬

作者发现CAAP1在MGC80-3细胞中低表达，在AGS细胞中高表达。构建CAAP1过表MGC80-3细胞。Wb和流式检测到细胞凋亡水平下降。构建CAAP1敲降AGS细胞发现凋亡水平增加。同时CAAP1促进了过表细胞中细胞的自噬。而敲降细胞中自噬小体含量减少。结论：CAAP1可抑制胃癌细胞凋亡，但促进胃癌细胞的自噬。

3.MIR-5100靶向结合CAAP1 3’UTR区调控其表达

作者使用TargetScanHuman数据库分析CAAP1的3’UTR序列。结果表明，3’UTR区与miR-5100之间有三个结合位点。之后利用荧光素酶报告实验验证，当增加miR-5100含量时3’UTR区荧光素酶活性被抑制。接着作者进行一些进一步验证，在此不讲了，有兴趣的小伙伴看下原文。

结果：CAAP1能直接与miR-5100结合，并受miR-5100负向调控。

4.MKL1抑制胃癌细胞凋亡和促进自噬并且靶向结合miR-5100

作者同时发现MKL-1在MGC803细胞中高表达，在AGS细胞中低表达。将MKL1表达质粒转染AGS细胞，发现Caspase3蛋白表达水平降低且自噬活性增加。之后在MGC80-3细胞中敲降MKL-1，结果细胞凋亡增加，自噬水平减少。

进一步对miR-5100启动子序列进行分析，发现在启动子处有MKL1的结合位点。同样使用荧光素酶报告实验表明，在miR-5100启动子中，MKL-1能促进荧光酶的活性，而miR-5100启动子突变对荧光素酶活性无影响。RT-PCR结果显示，当MKL1过表达时，miR-5100的表达量增加。然后对转染miR-5100的AGS细胞进行ChIP分析，相比于对照组，MKL1可与miR-5100启动子相结合，验证了荧光素酶结果。

结论：MKL1可以与miR-5100启动子结合促进其表达，并且MKL1能够影响胃癌细胞的凋亡和自噬。

5.MKL1靶向CAAP1启动子促进CAAP1蛋白表达

作者进一步探讨MKL1抑制胃癌细胞的分子机制，对CAAP1启动子序列进行了分析，发现同样可以结合MKL1。之后荧光素酶报告实验结果表明，MKL-1能促进CAAP1启动子荧光素酶活性。q-PCR和Wb表明，MKL1能促进CAAP1的转录和蛋白的表达。对转染MKL1的MGC80-3细胞进行了ChIP分析，MKL1能与CAAP1启动子相结合。结论：MKL1可与CAAP1启动子结合，促进CAAP1表达，抑制胃癌细胞凋亡，促进自噬。

6.MIR-5100对裸鼠移植瘤的抑制作用

作者构建了高表达miR-5100的AGS细胞系并注射到裸鼠体内。结果显示高表细胞的成瘤体积和重量均小于对照组。接下来，HE染色和免疫组化表明对照组肿瘤组织中CAAP1蛋白表达水平高于实验组，其中和紫杉醇联合治疗组中CAAP1蛋白表达水平最低。Wb检测表明，miR5100过表组肿瘤组织中Caspase3蛋白表达增强，而LC3B蛋白表达下调。与紫杉醇联用组裂解Caspase3蛋白表达高于对照组，LC3B蛋白表达也下调。结论：miR-5100在体内同样能促进胃癌细胞凋亡，抑制自噬。

7.MKL1/miR-5100/CAAP1轴调控胃癌细胞的凋亡和自噬

在这项研究中miR-5100通过抑制CAAP1的3’UTR和抑制自噬来促进胃癌细胞凋亡，而MKL1可以靶向CAAP1启动子来抑制胃癌细胞的凋亡和促进自噬。同时MKL1也可以促进miR-5100的表达。提示MKL1/miR-5100/CAAP1可能是影响胃癌细胞凋亡和自噬的反馈调节因子。作者为了验证假设，将MKL1和miR-5100抑制剂转染AGS细胞系。当MKL1和miR-5100抑制剂共转化时，Wb结果显示CAAP1蛋白的表达高于对照组，LC3BII/I蛋白比值增加，Caspase3减少，流式检测细胞凋亡水平明显降低。共聚焦显微镜下发现细胞自噬小体增加。结论：MKL1/miR-5100/CAAP1轴确实存在于胃癌细胞中，并调控胃癌细胞的凋亡和自噬。