摘 要：目的 利用网络药理学方法研究黄芪治疗糖尿病肾病（DN）的作用机制。方法 以化合物的口服生物利用度（OB）和类药性（DL）为标准，依据中药药理学技术平台（TCMSP）数据库、小分子靶点预测平台（SwissTargetPrediction）、人类基因组注释数据库（Genecards）预测和筛选黄芪的活性成分及治疗DN的作用靶点。采用Metascape数据库对作用靶点的基因本体（GO）注释和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路进行富集分析和蛋白功能归属。结果 从黄芪中筛选得到槲皮素、山柰酚、异鼠李素、芒柄花素、黄芪皂苷I～IV等24个活性成分，作用于172个DN靶点，筛选出表皮生长因子受体、血管内皮生长因子受体、丝裂原活化蛋白激酶、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子等18个关键靶点。调节晚期糖基化终末产物及其受体（AGEs-RAGE）介导的信号通路、磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/叉头框转录因子O（PI3K/Akt/FoxO）信号通路、核转录因子–κB（NF-κB）信号通路、Janus激酶/信号转导子和转录激活因子信号通路等关键代谢通路。参与物质代谢、氧化还原、信号转导、炎症反应等多种生物过程。结论 黄芪及其活性成分通过多个靶点、多条通路发挥治疗DN的作用。
糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）是糖尿病的重要并发症之一。DN的发生、进展与慢性炎症反应、氧化应激、糖脂代谢紊乱、肾脏血流动力学改变等多种因素相关。相关研究显示，中医药在DN的治疗中发挥着独特的作用。基于关联规则和因子分析，对治疗DN中药组方规律的研究[1]显示，黄芪Astragali Radix为使用次数最多的中药。黄芪的药用迄今已有2 000多年的历史，有增强机体免疫功能、利尿、抗应激、降压等作用[2]。近年来，大量研究[3]表明黄芪及黄芪经方对DN的治疗有积极的作用，可明显改善患者症状，降低尿蛋白，改善肾功能，但黄芪治疗DN的物质基础及作用机制仍不清楚。因此，本研究采用网络药理学的研究策略，对黄芪主要化学成分及其治疗DN的作用机制进行较全面系统地分析，为后续研究提供一定的理论基础。
1 资料与方法
1.1 主要化学成分的收集与筛选
利用TCMSP数据库[4]（http://ibts.hkbu.edu.hk/ LSP/tcmsp.php）收集黄芪的主要化学成分；根据化合物药动学参数中口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18的标准[5]，并结合文献报道筛选出候选化合物。
1.2 药物作用靶点的筛选
通过TCMSP检索候选化合物靶点，将候选化合物靶点通过蛋白质数据库（UniProt）中的UniProtKB搜索功能转化为相应基因。利用Swiss TargetPrediction（http://www.swisstargetprediction. ch/）平台，预测候选化合物的潜在靶点。将2个数据库检索到的化合物靶点合并，删除重复基因，即得药物作用靶点基因。
1.3 黄芪治疗DN的靶点搜集
在Genecards数据库中输入关键词“diabetic nephropathy”，得到DN相关靶基因。利用比较毒物遗传性数据库（CTD）的检索功能，在“Diseases”中输入“diabetic nephropathy”，点击“Gene”项，即可找出与DN相关联的所有基因，选取以“M”标识代表经过实验验证的基因。将2个数据库的基因整合，去除重复项得到DN相关基因。将DN靶基因与药物作用靶点基因映射筛选，找出两者的交集基因，得到黄芪治疗DN的潜在靶点。
1.4 网络的构建与分析
1.4.1 成分靶点网络的构建 采用Cytoscape 3.7.1软件构建黄芪治疗DN的成分靶点网络。在该网络中，节点代表化合物、靶蛋白，边代表化合物–靶点的相互作用。采用Cytoscape3.7.1软件中的“Networkanalyzer”功能，对网络的拓扑属性进行分析，计算节点连接度（degree）、节点介度（betweenness）和节点紧密度（closeness）3个重要网络拓扑参数[4]。最后利用网络拓扑属性分析黄芪治疗DN的主要活性成分。
1.4.2 靶蛋白相互作用（PPI）网络的构建 在STRING平台构建靶蛋白PPI网络，物种设为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设为中等置信度“Medium confidence”0.4，其余参数保持默认设置。并运用Cytoscape 3.7.1对PPI网络进行拓扑属性分析，筛选PPI网络中的关键靶蛋白。
1.5 基因功能和通路富集分析
将黄芪治疗DN的潜在靶点导入Metascape平台，输入物种和分析物种均选择为“H. sapiens”，设置P＜0.01，对作用靶点进行GO注释分析及KEGG通路分析，筛选排名靠前的生物过程和通路，采用GraphPad Prism6.0软件对结果可视化。
2 结果
2.1 黄芪主要活性成分的筛选
利用TCMSP数据库共检索出黄芪化学成分87个。根据OB≥30%、DL≥0.18的原则，再结合文献报道[6-7]，补充一些虽然OB、DL值较低，但含量较高，有药理活性的成分，如黄芪皂苷，最终筛选出候选化合物24个，主要包含黄酮类如槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）、芒柄花素（MOL0003930）及毛蕊异黄酮（MOL000417）等和皂苷类（黄芪皂苷I～IV），见表1。
2.2 黄芪作用靶点预测
通过TCMSP共检索出潜在靶点462个，删除重复项，共获得213个潜在靶点。基于Swiss TargetPrediction平台共获得345个基因靶点，删除重复项，得到155个潜在靶点。将2个平台预测基因合并，删除重复项，共得到332个潜在靶点。通过与Genecard数据库和CTD数据库中DN相关基因比对，得到172个化合物靶点与疾病靶点的交集，预测为黄芪治疗DN的靶基因。
2.3 网络图分析
2.3.1 成分靶点网络 如图1所示，以172个靶基因作为黄芪治疗DN的靶点，建立黄芪治疗DN的成分靶点网络图，共有196个节点、387条边。节点代表了活性成分及潜在的靶点，边代表了活性成分与靶点的相互作用，黄芪共有24个活性成分作用于相同或不同的靶点，网络图充分体现了黄芪多成分、多靶点治疗DN的机制。
经计算，该网络连接度平均为3.95，介度平均为0.02，紧密度平均为0.35。槲皮素、山柰酚、黄芪皂苷等14种成分连接度、介度、紧密度值均大于等于其平均值，提示这些成分可能是黄芪治疗DN的主要活性成分。主要活性成分的拓扑参数见表2。
2.3.2 靶蛋白PPI网络分析 如图2所示，PPI网络共有172个节点，3 369条相互作用连线。经计算，整个网络节点“连接度”中位数为32，因此，选择“degree≥64”的节点作为候选靶点（大于等于2倍中位数值），共筛选到36个候选靶点；接着对候选靶点的相互作用信息进行提取分析，并以连接度、介度、紧密度值大于其相应中位数为筛选条件进一步筛选节点，最终得到黄芪治疗DN的关键靶点 18个。
将18个关键靶点导入Metascape数据库，获得靶点对应的蛋白功能，结果见表3。表明黄芪治疗DN过程，有转录因子、酶和信号通路等相关蛋白物质的参与。
2.4 GO注释分析和KEGG富集分析
使用Metascape数据库对黄芪治疗DN的172个潜在靶点进行GO注释分析和KEGG通路分析，并通过GraphPad Prism 6.0将分析结果可视化。结果见图3。
GO注释分析由分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biologicalprocess，BP）、细胞组成（celluar component，CC）3个部分组成。由图3可知，BP（图3-A）中排名靠前的有对氮氧化物、氧化应激的调节，细胞运动正调节，细胞因子介导的信号通路、MAPK信号通路；MF分析（图3-B）主要是蛋白域特异性结合活性、蛋白激酶活性、丝氨酸水解酶活性、转录因子结合活性靠前，主要涉及调节蛋白激酶、转录因子活性；在CC分析（图3-C）中靠前的是膜筏、突触、细胞外基质、受体复合物等，主要集中在细胞膜和蛋白复合物上。
KEGG通路分析（图3-D）显示，黄芪治疗DN靶点涉及靠前的通路主要有肿瘤信号通路、AGEs-RAGE介导信号通路、内分泌抵抗信号通路、转录激活因子（Jak-STAT）信号通路、胰岛素抵抗（IR）信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、叉头框转录因子O（FoxO）信号通路、核转录因子-κB（NF-κB）信号通路等。
3 讨论
3.1 DN发生、发展的分子机制研究
晚期糖基化终末产物（advancedglycation end products，AGEs）及其受体（receptorof advanced glycation end products，RAGE）系统能增强氧化应激、激活NF-κB途径，刺激产生一些细胞因子和生长因子，在糖尿病并发症的发生、发展中起重要作用。刘智辉等[8]研究发现，AGEs与RAGE作用后可引起活性氧（ROS）产生增加，氧化应激可加重肾脏系膜细胞的损伤，引起足细胞凋亡。AGEs与RAGE结合后，激活了磷酯酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路。PI3K/Akt信号通路是胰岛素调控血糖的关键通路之一，与IR关系密 切[9]。张翠香等[10]研究发现，与对照组相比，DN模型组大鼠肾组织中PI3K与Akt活性升高。目前DN也被认为是一种由糖脂代谢紊乱引发的炎性反应性疾病，炎症反应在DN的发生发展中发挥重要作用。活化的Jak-STAT信号通路通过诱导炎症细胞活化、促进炎症介质表达、增加促炎因子产生等途径，导致糖尿病肾组织炎性损伤，最终引起DN[11]。NF-κB是一种多靶向的细胞因子，其激活可导致多种炎症介质如IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6等释放，引起肾脏炎症反应，加速肾间质纤维化进程。
3.2 黄芪治疗DN的主要活性成分与关键靶点探讨
本研究得到的黄芪治疗DN的成分靶点网络图显示槲皮素、山柰酚、异鼠李素、芒柄花素、黄芪皂苷等14种化合物的连接度与介度较高，可作用于多个DN靶点，提示这些成分可能是黄芪治疗DN的重要成分，值得进一步研究。槲皮素的潜在靶点最多，有106个，其次是山柰酚有47个潜在靶点。朱开梅等[12]研究发现，槲皮素可通过干预转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smad7通路，抑制足细胞分泌VEGF，对DN起保护作用。常陆林等[13]研究发现，槲皮素能通过改善氧化应激和抗炎作用，减少炎症因子人单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、IL-6、TNF的表达，改善早期糖尿病肾功能。汤利华等[14]研究发现，山柰酚可抑制DN大鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）炎症小体的激活，抑制IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α等炎症因子的表达，对DN大鼠肾功能起保护作用。研究显示[15]，山柰酚可抑制大鼠及人肾小管细胞中RhoA/Rho激酶活化介导的炎症反应，减少TNF-α和IL-1β等促炎因子的表达，可作为治疗DN的潜在药物。异鼠李素能抑制糖尿病大鼠肾组织NF-κB系统过度活化，降低炎症因子TNF-α、IL-6、TGF-β1的蛋白和mRNA水平，延缓DN进展[16]。
肖峰等[17]研究发现，黄芪皂苷提取物对糖尿病大鼠具有一定的肾脏保护作用。黄芪总苷通过上调基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP9及IL-10的分泌发挥抗纤维化作用[18]。黄芪甲苷在黄芪中含量最高[6]，研究发现[19]黄芪甲苷能够抑制肾脏中NF-κB介导的炎症基因表达，降低糖尿病患者血清中TNF-α、MCP-1的含量，减少足细胞的损伤。王琳琳等[20]研究发现，黄芪甲苷能下调Akt/NF-κB信号通路p-Akt蛋白表达，对高糖环境下人肾小球系膜细胞的氧化应激损伤起保护作用。黄芪甲苷通过影响细胞周期蛋白Cyclin D1（CCND1）的表达，对肾小球系膜细胞氧化应激损伤起保护作用[21]。
PPI网络分析结果发现，EGFR、VEGFA、JUN、MAPK8、IL-10、IL-6、TNF等18个靶标是PPI网络的关键靶蛋白。EGFR的激活上调了ROS产生和内质网应激，在DN发病机制中起重要作用。VEGF与DN患者的氧化应激状况相关，IL-10、IL-6、TNF是促炎因子，MAPK8基因与脂肪代谢有关，炎症反应和脂质代谢紊乱是DN发生的重要危险因素[22]。18个关键靶标主要与氧化应激、炎症反应相关，黄芪的主要成分槲皮素、山柰酚、黄芪甲苷等通过调节EGFR、JUN、MAPK等靶蛋白，减轻氧化应激，抑制IL-10、IL-6、TNF等炎症介质的表达，起到延缓DN进展的作用。
3.3 黄芪治疗DN的信号通路探讨
KEGG分析结果显示，黄芪治疗DN靶点涉及通路主要与氧化应激、炎症反应和脂质代谢紊乱有关。王兴红等[23]研究发现，槲皮素可通过调控肾脏p38-MAPK/NF-κB信号通路，减轻氧化应激，抑制炎症反应，对DN大鼠肾脏起保护作用。陈妮等[24]研究发现山柰酚通过调节p38MAPK通路，对高糖培养的大鼠肾系膜细胞起到保护作用。田心等[25]研究发现刺芒柄花素对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞NF-κB信号通路及系膜细胞增殖具有抑制作用。有研究表明[26]黄芪甲苷能在体外抑制p38-MAPK通路，减轻氧化应激，改善足突融合及足细胞凋亡，维持足细胞数目的稳定，减少尿蛋白排泄，延缓DN进展。马可可等[27]研究发现，黄芪甲苷可通过抑制PI3K/Akt/FoxO1信号增加肾组织细胞自噬活性，减缓DN的发展进程。因此，可推测黄芪的主要成分槲皮素、山柰酚、黄芪甲苷等通过调节氧化应激、炎症反应、足细胞凋亡等途径，起到延缓DN进展的作用。
VEGF尤其是其亚型（VEGF-A）可影响肾小球滤过功能，启动并加重DN的进展。足细胞产生VEGF对维持肾小球结构和功能具有重要意义，Veron等[28]观察到足细胞过表达VEGF的小鼠发生蛋白尿、肾小球损伤、系膜增生、基膜增厚等一系列DN的病理改变。而DN患者的肾活检组织中却发现VEGF的表达降低，且VEGF的表达与蛋白尿呈负相关。表明在疾病状态下，VEGF过多或过少表达均能引起肾脏损伤。令笔者感兴趣的是黄芪是一种双向调节剂，推测黄芪可通过维持足细胞VEGF的表达平衡，发挥减轻肾脏损伤作用。关于黄芪通过抑制VEGF表达对DN大鼠肾功能发挥保护作用的研究已有文献报道[29]。但黄芪通过减少足细胞丢失，增加VEGF表达而延缓DN发生发展的研究尚未见报道，本课题组后期将进行相关研究。
3.4 黄芪治疗其他疾病的物质基础及分子机制研究
KEGG分析显示涉及疾病通路最多的是肿瘤疾病相关信号通路，表明黄芪在治疗肿瘤疾病中有一定的功效。近年来，关于黄芪抗肿瘤的作用日渐被重视，其临床应用也扩展到对肿瘤患者的治疗当中。目前黄芪的抗肿瘤作用成分主要集中在黄芪皂苷和黄芪多糖。黄芪多糖可增强机体免疫力，抑制癌细胞的增殖，与抗癌药物联合使用具有协同作用[30]。黄芪皂苷可通过影响VEGF/MMP信号通路介导的抗血管生成和PI3K/Akt/mTOR通路介导的癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用[31]。
综上所述，黄芪可能通过参与物质代谢、信号转导、炎症反应等过程改善DN肾损伤状况；调控AGEs-RAGE、PI3K/Akt/FoxO、NF-κB及Jak-STAT等信号通路发挥延缓DN发生发展作用。本研究通过网络药理学的技术与方法，阐明了黄芪活性成分、靶点、通路之间相互作用的关系，发现黄芪及其活性成分能通过多靶点、多通路发挥抗DN的作用，为后期的验证性研究提供了理论依据。
参考文献（略）
来 源：宋建波，廖 晖，李元平．基于网络药理学探讨黄芪治疗糖尿病肾病作用机制 [J]. 中草药, 2020, 51(11):2988-2996.
