自然界中种类繁多，形态各异的植物产生了大量结构复杂多样的天然产物（或者称为次生代谢产物）。这些天然产物既可以作为内源性小分子参与植物重要生理活动，例如调控植物自身的生长发育（例如赤霉素、脱落酸等植物激素）以及抵御病虫害（例如豌豆素、白藜芦醇等植保素）， 同时也是治疗人类重大疾病的创新药物分子的主要来源，例如：吗啡、阿司匹林、紫杉醇，喜树碱、青蒿素等。因此，解析植物天然产物的生物合成途径对于植物生物学研究、生态学研究、以及开发创新药物治疗人类重大疾病和植物保护分子都具有重要意义。
与微生物相比，研究植物天然产物生物合成途径存在着更大的挑战。首先，植物基因组庞大，遗传背景复杂，难以获取高质量基因组序列。其次，植物天然产物生物合成基因大多数情况下并不成簇分布在植物基因组中，无法利用微生物天然产物生物合成研究中常用的基因簇挖掘（“genome mining”）的方法来鉴定植物天然产物生物合成途径。最后，植物，特别是非模式植物，生长周期较长，遗传操作相对复杂，很难通过体内敲除直接验证基因功能。目前，在植物天然产物生物合成研究中的方法十分有限，包括了转录组分析、活性导向蛋白分离以及基于同源性的反向遗传学研究，如图1所示。但这几种方法也有自身的一定局限性，不能有效促进植物中全新功能蛋白的发现，因此，开发出新颖的研究方法对于植物天然产物生物合成来说具有重要意义。
2020年5月25日，北京大学化学与分子工程学院雷晓光课题组、中国医学科学院药物研究所戴均贵课题组以及中国中医科学院黄璐琦课题组合作，在Nature Chemistry杂志上发表以FAD-dependent enzyme-catalysed intermolecular [4+2] cycloaddition in natural product biosynthesis为标题的文章，解析了来源于传统中药桑白皮中的活性天然产物生物合成关键步骤，发现了自然界中存在的首例催化分子间Diels-Alder反应的单功能酶。该工作还发展了一类新颖的、基于“天然产物生物合成中间体分子探针”的化学生物学策略，为解析植物天然产物生物合成途径提供了新的研究思路。
在本文中，作者开发出一种基于天然生物合成中间体分子探针（Biosynthetic Intermediate Probes， BIPs）的靶标垂钓策略，并结合活性导向蛋白分离以及转录组测序等方法，成功在桑树愈伤组织中鉴定出两个FAD依赖蛋白（MaMO和MaDA），其中MaDA为从自然界中发现的首个催化分子间Diels-Alder反应的单功能酶。
桑科植物的根皮是一种传统的中药——桑白皮，它具有止咳、平喘、抗炎等功效。于此同时，现代医药学研究发现，桑白皮具有抗HIV的功效，其作为“复方SH”的主要有效成分已被泰国政府批准用于治疗艾滋病。桑白皮中含有一类特殊的Diels-Alder（D-A）类型加合物，这类天然产物具有共同的环己烯骨架结构，且具有多样的生物活性，包括抗氧化，抗菌，抗病毒，以及潜在的治疗糖尿病的功效 （J. Asian Nat. Prod. Res. 2014, 16, 690–702.）。生源上，这类天然产物是由查尔酮（亲二烯体）和不同二烯体发生分子间Diels-Alder反应形成的，如图2a/b所示（J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1990, 8, 610-613）。微生物来源的 D-A 反应酶虽然已屡见不鲜，但到目前为止，植物来源的 D-A 反应酶还鲜有报道（Chem. Rev. 2016, 117, 5367-5388）。目前，tabersonine synthase (TS) 是唯一已知的催化分子内D-A反应的植物来源的D-A反应酶（Nat. Chem. Biol. 2020, 16, 383–386）。另外，除了Macrophomate synthase和Riboflavin synthase以及近期协和药物所的胡友财课题组报道了催化分子间杂D-A反应的EupfF（J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 14052-14056）外，目前已知的D-A反应酶绝大部分催化的是分子内的Diels-Alder反应，因此，揭示桑树中全新的分子间Diels-Alder 反应酶，不仅会极大地丰富我们对D-A反应酶的认知，也会促进桑科植物中这类具有重要生物活性地D-A类型天然产物的开发和利用。
为了找寻桑树愈伤组织中催化morachalcone A（2）和二烯体（4）发生分子间D-A反应的酶，作者提出了一种基于天然生物合成中间体探针（Biosynthetic Intermediate Probes, BIPs）的靶点垂钓研究策略，如图2c所示。通过对细胞裂解液的分离纯化，研究人员可以提高目标蛋白的含量，降低假阴性结果的可能性；同时通过分离纯化，去除掉体系中的干扰蛋白，降低假阳性结果的可能性。基于生物合成中间体探针的靶点垂钓可以与转录组分析以及活性导向蛋白分离等方法形成优势互补，从蛋白和底物有结合的角度为研究植物天然产物生物合成途径提供新的思路。
为了合理设计和合成BIPs，作者对亲二烯体morachalcone A（2）进行了SAR研究（图3a/b），并合成了探针分子8。随后，作者将该生物合成前体探针分子8与分子筛纯化后高活性组分孵育并进行紫外交联，然后进行后续的“pull-down”实验，最后通过银染找到了可能与探针分子存在相互作用的蛋白，如图3c中红色箭头所示。LC-MS/MS数据显示，在该条带中包含了BBE-like proteins，这暗示着桑树中的BBE-like protein很可能是D-A反应酶。
在前期的基于活性导向的蛋白分离的实验中，作者证明了桑树中BBE like protein参与二烯体4的形成，而通过靶点垂钓实验也暗示着桑树中某些BBE-like proteins催化了分子间的D-A反应，于是作者对桑树愈伤组织进行了转录组测序，共鉴定出了14个BBE-like protein家族蛋白，并对转录水平最高的两个基因（MaMO和MaDA）进行了表达纯化以及功能验证。酶学活性测试发现，MaMO能够氧化moracin C（3）生成二烯体（4），而MaDA却不能。MaDA能够催化二烯体（4）和morachalcone A（2）发生分子间[4+2]环化反应，而MaMO在同样条件下却不能催化该反应的发生。这说明MaDA是首个催化分子间[4+2] 环化反应的单功能酶。此外，作者还对这两个酶的酶学性质进行了表征，如图4所示。
随后作者探究了MaDA的底物适应性。作者发现，不同的morachalcone A的衍生物（5-7）及其类似物（15，16）均能被MaDA识别，但去掉异戊烯基后的化合物14不能被识别。另外，化合物6和16的转化率也显著降低，如图5a所示。这些结果暗示着morachalcone A（2）中的异戊烯基以及2和2’号位上的羟基可能与MaDA有较强的相互作用。作者也合成了五种不同的二烯体，利用MaDA催化的endo专一性的D-A反应，实现了包括chalcomoracin在内的多个天然产物及其类似物的首次不对称全合成，如图5b所示。这些实验结果表明，作为一个催化分子间Diels-Alder反应的酶，MaDA对二烯体和亲二烯体都具有很好的底物兼容性，可作为一种高效的生物催化剂，用于D-A类型化合物的合成。同时，这些结果也揭示了桑树中endo D-A类型天然产物结构的多样性可能来自于MaDA底物的宽泛性。
图5 MaDA底物适用性的探究
为了探究该分子间[4+2]反应的机理，作者首先对非酶促的分子间[4+2]反应进行了DFT机理计算。DFT计算表明，endo 产物过渡态比exo产物过渡态在能量上低2.8–3.0 kcal mol–1，如图6a所示，这解释了为什么该反应展现出endo选择性。在endo 产物过渡态中，将要形成的两根C-C键分别为2.03 and 2.69 Å （图6a），这说明该环化反应可能是通过协同但不同步的反应机理进行的（concerted but asynchronous reaction）。作者还测定了酶促反应中二烯体10上不同位置的KIE数值（图6b），其实验结果也支持MaDA催化的[4+2] 环化反应是一个协同但不同步的Diels-Alder反应。这些数据支持MaDA是一个真正意义上的分子间Diels-Alder反应酶。
图6 DFT计算（a）以及KIE测定（b）
为了进一步探索MaDA的催化机制，作者成功解析了MaDA的晶体结构（2.3 Å），如图7a所示。通过将产物chalcomoracin (1)对接进MaDA的口袋中发现，F356、N357、 L358、 L373、N374和F375可能与二烯体（4）有相互作用，而V177、I259、F292、Y192 和 R443可能与亲二烯体morachalcone A（2）有相互作用，如图7b所示。基于此，作者将可能与产物形成相互作用的氨基酸进行了突变，结果显示，F375，R443，F356 I259以及Y192对于维持MaDA的活性至关重要（图7c）；同时，作者还发现氧化态的FAD对于MaDA的活性也非常重要，如图7c所示。
综上所述，研究者通过活性导向蛋白分离，基于生物合成中间体探针（biosynthetic intermediate probes, BIPs）的靶点垂钓和转录组分析相结合的策略成功在桑树愈伤组织中鉴定了两个FAD依赖的蛋白， MaMO和MaDA。其中，MaDA为首例催化分子间[4+2]环化反应的单功能酶。作者通过DFT以及KIE实验证明了该酶促反应为协同但不同步的Diels-Alder反应，因此MaDA是首个从自然界中发现的、催化分子间反应的Diels-Alder反应酶，从而结束了学术界一直存在的“自然界是否有真正意义DA反应酶”的争论。作者还成功解析了MaDA的晶体结构，并初步阐明了底物和蛋白相互作用的机制。此外，MaDA有很好的底物宽泛性，利用MaDA实现了多种D-A类型天然产物的酶法合成。该酶法合成展现出普通化学方法难以实现的高效性与立体化学专一性，体现了MaDA在生物催化中的优势和特点，为发展酶催化合成方法来高效制备结构多样的功能有机分子开辟了新的研究方向。此外，本研究所提出的基于天然产物生物合成中间体分子探针（BIPs）靶点发现的化学生物学研究手段也会为阐明天然产物生物合成途径、发现新颖的生物合成酶提供新的研究方法与思路。最后，该类药用植物来源天然产物生物合成途径的解析也为后继合成途径重建，实现植物天然产物的微生物异源生物合成，并开展结构衍生化研究，提升功能活性铺平了道路。
在本工作中，雷晓光课题组高磊博士，戴均贵课题组苏聪博士，雷晓光课题组杜晓霞博士以及黄璐琦课题组王瑞杉博士为共同第一作者。北京大学雷晓光教授，中国医学科学院药物研究所戴均贵研究员以及中国中医研究院黄璐琦研究员为共同通讯作者。北京生命科学研究所的周宇博士和黄牛研究员以及UCLA的Chen Shuming博士和K. N. Houk教授在计算模拟，DFT计算方面做出了重要贡献。此外，北京生命科学研究所的陈涉研究员，中国中医科学院的郭兰萍研究员，北海道大学的Oikawa教授，Minami副教授以及刘成伟助理教授，以及帝京平成大学的Hano教授和Shimazaki教授也在质谱分析，转录组分析以及酶活测试等方面提供了重要帮助。
