3’UTR是做什么的?

和大家解释一下,由于本来想写一个APA(alternative polyadenylation, 选择性多聚腺苷酸化)的数据库的,对于这个方面的东西不是很懂。然后就查了一下,结果发现这个东西是位于3’UTR的一个调节方式,然后就想查查3’UTR的功能。结果就发现了这篇新出炉的文献。然后就有了下面的这个翻译(其实主要还是发现APA可以来发一些文章啥的,所以才折腾这么多,这个具体后面我们慢慢介绍)。

这个综述从3’UTR功能发现的角度来进行的讲解,其中最后讲到了关于3’UTR目前的实验方法。关于实验方法,只是翻译了第一部分,剩下的只是提供了标题,剩下的有感兴趣的可以去看原文。

另外,由于并不是专门研究3’UTR或者基础实验的,中间有的文字可能用的不是很准确,所以有可能会影响阅读。如果看不懂还是建议看原文。

一分钟看完综述版本

我们长期基于中间法则(DNA-RNA-Protein)的研究过程当中,人类基因组和更简单的真核生物的基因组中,蛋白质编码基因的数量是相似的。由于十分相似所以就不可能存在物种的差异性,为了寻找人类物种的复杂差异性,我们发现在mRNA成熟前的3’UTR区随着物种的进化其序列不断的延伸。另外由于选择性多聚腺苷酸化的产生也就导致了很多最终成熟mRNA序列相同但是前体的3’UTR不同的3’UTR异构体。而这些异构体有时候会发挥不同的功能。所以我们认为3’UTR可能在生物复杂性的调节中发挥重要作用。

目前对于3’UTR的功能的研究我们发现3’UTR主要有这些功能:

  1. 通过富AU元件(rich AU element)来调节mRNA的稳定性
  2. 3’UTR可以调控mRNA的定位表达
  3. 3’UTR可以调控mRNA的翻译
  4. 3’UTR结合多个RNA绑定蛋白来形式调控功能
  5. 3’UTR可以调控蛋白-蛋白相互作用
  6. 目前对于3’UTR研究的新方向: 使用CRIPR来进行研究;研究3’UTR特异性的翻译;研究3’UTR的异构体时间调节作用;确定3’UTR绑定蛋白之间的协同左右。其中第一个有翻译,剩下的三个没有翻译。想要了解的可以看原文。

下面开始我们的原文的翻译。全文9000字,阅读需要好多分钟。。。

1. 前言

基于中心法则,储存在DNA当中的遗传信息通过mRNA传递给蛋白。多年来人们一直以为从DNA到蛋白质的信息转移完全是通过将mRNA的编码区翻译成蛋白质的氨基酸来实现的。虽然众所周知,mRNA的5‘和3’端也含有非翻译区(UTR),普遍的看法是,这些区域通过调节mRNA的翻译或稳定性在很大程度上调节了mRNA的定位或蛋白质的表达。

在这种以蛋白质为中心的观点下,经过研究发现,人类基因组和更简单的真核生物的基因组中,蛋白质编码基因的数量是相似的。此外,不同物种的蛋白质大小基本相似。这表明蛋白质序列具有显著的保守性。在这种情况下,就出现了另外一个问题:什么使高等生物体具体更大的复杂性呢?在这种情况下,研究人员注意到3‘UTR所占据的序列长度在高等生物的进化过程中得到大大延伸,并且与生物的细胞复杂性相关。同时研究也发现,3’UTR区总是有几个到几百个核苷酸(NT)是高度保守的。进化过程中3‘UTR序列的扩展,再加上最近发现,储存在3’UTR中的遗传信息也可以通过3‘UTR介导的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的形成传递给蛋白质,表明3’UTR可能在生物复杂性的调节中发挥重要作用。如果是这样的话,为什么3‘UTR不是每个人关注的中心呢?

对于3’UTR功能研究手段的缺乏限制其研究的重要因素。和转录或翻译调控或microRNA(MiRNA)介导的转录后调控研究相比,3‘UTR非依赖miRNA的研究远远落后。大多数的3’UTR主要是通过RNA绑定蛋白(RBP)来发挥作用的。但是相较于miRNA结合位点的研究,很多RBP的结合位点(motif)目前还不是很情况。即使有一些RBP的motif已经很明确了,但是这些motif经常间隔很远的距离,这样就不足以形成功能性的motifs。另外呢,很多RBPs具有相同的motif。这样我们就不是很清楚他们之间到底是竞争还是合作的关系了。最后,超过一半的人类基因使用交替的切割和多聚腺苷酸来产生仅在3‘UTR上不同的mRNA异构体。由于从不同的3’UTR异构体产生的蛋白质的氨基酸序列是相同的,这使得对3‘非编码区的异构体的研究具有挑战性。

2. 含有富AU元素的3‘UTR调节mRNA稳定性

核苷酸测序是在20世纪70年代发展起来的,它揭示了编码区和多聚腺苷酸信号之间存在未翻译的序列。掌握不同生物体基因的DNA序列可以让研究者进行第一次比较基因组分析。不同物种之间碱基的差异变化(碱基替换率)可以反映功能上的变化。早期的比较基因组分析发现非翻译区的碱基替换程度高于编码区,但它们也显示了3‘UTR中有一部分序列也存在高度的序列保守性。其中最有意思的发现是,研究人员发现在编码肌动蛋白蛋白的同源基因的3‘UTR序列在生物中高度保守,但当比较具有不同功能或组织分布的相似肌动蛋白异构体时,3’UTR序列高度差异。高度的保守性表明3‘UTR具有重要的调控作用,而3’UTR异构体序列的差异则表明3‘UTR含有额外的遗传信息来区分高度相似的蛋白质的功能。

通过对c-fos基因转化能力的研究首次发现3’UTR含有特异的c-fos功能元件。病毒内的fos(v-fos)基因可以在培养基当中转换为成纤维细胞;而细胞当中的fos(c-fos)基因就缺乏这种特性。有意思的是,这种功能上的差异不是由于这两个fos编码的蛋白的微小的差异造成的,而是由于其3’UTR的差异造成的。

当研究人员去掉3‘UTR时,c-fos也可以转化为成纤维细胞。这个发现激发了人们对于3‘UTR的研究,通过研究我们发现了富AU元件(rich-AU)。这种富AU元件可以导致mRNA的不稳定性(人们通过将富AU元件元件转移到一种稳定的、异源的mRNA,即β-actin mRNA上来进行研究得到的结果)。几乎同时,我们发现在一些富AU元件主要位于某一类的mRNA当中,这类的mRNA主要编码包括细胞因子;淋巴因子;生长因子和癌基因等在内的短期因子。同时呢,也发现富AU元件有时候相较于一些蛋白编码区域更加保守,这也 说明了在不同的物种当中富AU元件都是形式相同的功能。

3. 3’UTR调控mRNA的定位

在发现3’UTR的同时,研究人员也发现了3’UTR是mRNA亚细胞定位的重要调节因子。早期关于mRNA定位的研究,主要集中在卵或者卵母细胞当中,但是mRNA的定位不仅在发育早期至关重要,在其他的细胞(成纤维细胞,神经元等)都具有很重要的作用。然而,生殖细胞和发育的早期阶段对于RNA研究特别有利,因为早期动物发育中的基因调控取决于在胚胎转录开始之前母体从卵母细胞沉积的mRNA。例如果蝇的Bicoid基因就是在发育早期通过不同的定位来发挥不同的作用的。而Bicoid基因的不同定位主要是通过其3’UTR区的一段630nt的片段来进行定位发挥作用的。

4. 3’UTR调控mRNA的翻译

mRNA的不同的定位允许其蛋白质产物在不同的位置上发挥作用。在神经元当中,3’UTR可以调节树突和突触局部蛋白的合成。除了调控不同地方的蛋白产物,3’UTR还是空间性蛋白产物的调节因子。研究发现3‘UTR调控翻译的研究是在果蝇卵母细胞中Oskar mRNA和蛋白表达的差异上发现的。Oskar mRNA决定果蝇后极的体型。虽然Oskar mRNA在整个卵子发生过程中都存在,但只有在Oskar mRNA定位到后极后才能检测到Oskar蛋白。紫外光(UV)交联实验证实RNA绑定蛋白 Bruno是Oskar翻译调控的调控因子。Bruno与Oskar mRNA的结合阻止了Oskar蛋白的过早翻译,并且对于Oskar在正确发育阶段的表达是必要的,因为Oskar mRNA只有在到达卵母细胞的后极后才被翻译。

5. RNA绑定蛋白绑定3’UTR的顺式反应元件并介导多个和3’UTR相反的作用

最初,富AU元件被认为是mRNA衰变元素。然后,他们被证明也抑制翻译。之后,人们发现富AU的元素也可以增加蛋白质表达。例如,在静息的免疫细胞中,富AU的元素抑制翻译,但在脂多糖(LPS)刺激T细胞后,它们需要快速诱导蛋白质表达。这就导致了这样一个想法的产生,即:不是顺式元件本身导致了蛋白的表达,而是特殊的反式作用因子的结合决定了特定的3‘UTR的功能。

这一调节原理在小鼠体内缺失了62nt长的、富含AU的保守元件的TNF-α基因里得到了体现。完全缺乏富含顺式调节的AU元素的小鼠会导致炎症性关节炎和炎症性肠病,并在5至12周时使小鼠死亡。在未受刺激的条件下,富AU的元素会破坏mRNA的稳定。TNF-α的AU元件在非造血细胞中永久抑制翻译,在造血细胞中暂时抑制翻译。因为在被LPS激活后,它们最初会增加造血细胞中mRNA的稳定性和翻译,而在后期,它们会变得抑制。综上所述,富Au的元素是重要的调控元素,它能够快速和高度动态地调节蛋白质表达,并具有敏锐的开关。

现在有超过10种的RNA绑定蛋白可以结合到AU元件上。tristetraprolin (TTP)或者KHSRP通过招募降解mRNA的外泌体复合物而导致不稳定。Hur的结合稳定了含有富含AU的mRNA,所以可能是通过它是的3’UTR不能招募外泌体。这些发现说明了一个重要3’UTR的重要的功能即:RNA绑定蛋白绑定到3’UTR的顺式元件上,作为一个接头来招募效应蛋白。这些募集效应蛋白来产生观察到的效应。RNA绑定蛋白的接头作用很重要,因为效应蛋白不能和富AU区域进行结合。

RBP(红色,橙色)与mRNA的3’UTR(浅绿色)结合并募集各种效应蛋白。外泌体(蓝色)的募集导致mRNA不稳定(左图),而运动蛋白(蓝色)的募集通过使用微管上的运动来调节mRNA的定位(灰色线;右图)。

3’UTR可以在不同的信号通路活跃的情况下产生不同的作用。这个可能是由于通路的活化改变了绑定同一位置的RNA绑定蛋白相对的表达量而引起的。RNA结合蛋白之间的竞争/合作最终将决定一个3’UTR的最终的功能。

相似的,单个RNA绑定蛋白可以在不同的发育阶段发挥不同的功能。在早期发育中,翻译主要通过Poly(A)尾长度进行调节,这是由CPEB(细胞质多聚腺苷酸元件[CPE]结合蛋白)决定的。CPEB与CPE结合可以调节mRNA的多聚腺苷酸、去烯化和翻译。CPEB通过绑定几个不同的因子来实现这些功能。CPEB可以同时和PARN和PAPD4结合。在卵母细胞中,含有CPE元件的mRNA具有短的Poly(A)尾巴导致的翻译抑制是由于在这些细胞中,PARN的活性高于PAPD4的活性,所以CPEB和PARN结合导致翻译抑制。卵母细胞受精后,CPEB被磷酸化,CPEB和PARN结合减少。这就导致了PolyA尾巴的加长,进而翻译启动。综上所述,在发育早期,蛋白质合成的时间调控通过3‘UTR发生,并由RNA绑定蛋白CPEB及其相关效应蛋白介导。因此,为了阐明不同的作用机制,需要对RBPs的相关效应蛋白进行鉴定和研究。

6. 超过一半的人类基因产生3‘UTR异构体

RNA聚合酶II对DNA的转录产生初级转录本,需要对其进行处理才能产生成熟的mRNAs。mRNA加工的步骤包括5’端加帽,内含子的剪接和3’端的切割/多聚腺苷酸。初级转录本在其3’端会延伸几千个核苷酸。随后一些切割和多聚腺苷酸化机制的因子与RNA聚合酶II一起移动,与功能性多腺苷酸信号的相遇导致内切。最后增加了聚(A)尾巴。因此,3‘端裂解和多聚腺苷酸化决定了3’UTR长度,由于长度的不同也就导致不同3’UTR异构体含有不同的顺式反应元件。

 

在发现3‘UTR调控基因表达的几个方面大约10年后,一项文献调查显示,许多基因产生不同的3’端不同的mRNA异构体。当时,已知有95个基因产生替代的3‘UTR,而31个基因利用内含子多聚腺苷酸位点来改变蛋白质的羧基末端以及3’UTR。大约在同一时间,利用新的技术(expressed sequence tag, EST)发现相当大一部分人类和小鼠转录本使用选择性多聚腺苷酸信号来产生具有不同3‘UTR异构体的mRNA。深度测序技术的发展使得能够在全基因组范围内绘制mRNAs的所有3‘端图谱的方法得以建立。这些3‘端测序方法表明,超过一半的人和小鼠基因产生不同的mRNA亚型,它们的3’UTR不同,但编码的蛋白质具有相同的氨基酸序列。

7. 3’UTR异构体比率因细胞类型而异,并随信号通路的激活而变化

3‘-末端测序方法提供关于3’UTR长度的信息,并定量测量替代的3‘UTR亚型水平。对来自不同组织的样品的3‘端测序显示,功能性多聚腺苷酸位点的位置在不同的细胞类型之间没有变化,但3’UTR异构体亚型的表达率是具有高度的组织和细胞特异性。关于3’末端测序的数据现在可以看网上查看(3 ′-seq: http://cbio.mskcc.org/leslielab/ApA/atlas/ ; polyA_DB: http://exon.njms.rutgers.edu/polya_db/v3/ ; polyAsite: http://polyasite.unibas.ch/)

与存在于大量样品中的RNA-seq数据相比,3‘端测序数据的可用性仍然有限。因此,如果能够从RNA-seq数据中提取备选3‘UTR的表达将是非常有帮助的。由于3‘UTR上的RNA-seq读取覆盖高度可变,因此需要谨慎使用所获得的数据。如果使用严格的标准来鉴定3‘-UTR亚型表达的差异,那么RNA-seq只能发现由3’-端测序方法识别的少量变化(10%-15%)。另一方面,不太严格的分析包含许多假阳性结果。此外,改变的方向(缩短或延长3’UTR)只有15%的事件被认为是显著的。因此,目前,3‘端测序是确定替代3’UTR表达的首选方法。

除了特定于细胞类型外,替代性3’UTR亚型的表达还对受体刺激和随后的信号通路激活产生响应,如在免疫细胞刺激或突触激活过程中所示。3’UTR亚型比例的变化可以通过使细胞暴露于细胞外刺激而实现,并且可以通过添加生长因子,细胞因子或神经递质通过实验模拟。最近发现,在小鼠卵母细胞从生发泡期到中期II的成熟过程的9个小时的过程当中中,3‘UTR长度发生了巨大的变化。对于20%的基因,3‘UTR异构体表达的改变导致了其miRNA和RNA结合蛋白的结合位点的变化,进而导致了蛋白表达发生变化。

8. 3’UTR调控蛋白-蛋白相互作用

由于替代的3‘UTR广泛存在,并且3’UTR序列在高等生物的进化过程中已经得到扩展。因此,我们想知道3‘UTR是否能够调节除了蛋白质表达的细胞过程。这一背景下,我们发现,一些蛋白-蛋白相互作用只有在其中一个互动伙伴被3‘UTR招募时才能建立(图1B)。这是SET和CD47之间的PPI的首次显示,然后扩展为人细胞和酵母中的其他质膜蛋白。

 

3’UTR通过介导3’UTR依赖性蛋白-蛋白相互作用(PPI)调节蛋白特征。尽管编码具有相同氨基酸序列的蛋白质,但3’UTR异构体仍可确定蛋白质功能。这是由3’UTR依赖性PPI引起的,PPI仅由3’UTR长异构体(右图)而不由3’UTR短异构体(左图)介导。结合3’UTR的RBP以及募集的效应子蛋白均按A进行颜色编码。

CD47膜蛋白是由含有短或长3‘非编码区(SU或LU)的异构体产生的。这些不同的异构体编码的蛋白质具有相同的氨基酸序列,分别称为CD47-SU和CD47-LU。结果发现,只有CD47-LU能够以3‘UTR依赖的方式与蛋白SET相互作用。因此,CD47-SU和CD47-LU存在于不同的蛋白质复合物中,因而可能具有不同的功能。与CD47-LU蛋白的SET结合导致更有效的质膜定位,更好地保护细胞免受巨噬细胞的吞噬,激活Rac1,能够形成片状脂质体,并提高γ照射后的细胞存活率。

3‘UTR能够调节蛋白质复合体的形成和决定蛋白质的功能,表明3’UTR编码的遗传信息可以传递给蛋白质。这种信息传递可以调节没有存在于氨基酸序列中的蛋白质功能。由于3‘UTR内包含的序列长度在高等生物进化过程中有所扩大,3’UTR可能通过提供有关蛋白质的额外信息,包括有关PPI、翻译后Modi UTR阳离子、蛋白质构象和蛋白质多功能的信息,从而导致更高的有机体复杂性。因此,有关蛋白质特征的信息可以在未翻译的mRNA序列中进行遗传编码。目前还没有证明3‘UTR可以调节蛋白质的构象,但这很可能发生,因为依赖于3’UTR的相互作用伙伴与新生肽链的氨基末端的结合可以改变新生蛋白质的折叠。

3’UTR通过介导3’UTR依赖性PPI调节多种蛋白质特征。这可能导致3’UTR依赖性蛋白复合物形成,3’UTR依赖性翻译后修饰(P)和3’UTR依赖性蛋白折叠。

虽然尚不清楚这一新的3‘非编码区功能有多广泛,但是似乎3‘UTR介导的PPI是常见的,因为它们也发生在细胞质和核蛋白上。这在由3‘UTR介导的IQGAP1和E3泛素连接酶BIRC3(也称为cIAP2)之间的相互作用中得到了详细的证明。BIRC3蛋白是由不同的3‘UTR异构体产生的。同样,从长3‘UTR亚型产生的BIRC3蛋白称为BIRC3-LU,而由短3’UTR亚型编码的BIRC3蛋白称为BIRC3-SU。长的BIRC3的3‘UTR促进了由BIRC3-LU、IQGAP1和RasGTPase Rala组成的蛋白质复合物的组装,而BIRC3-SU不能形成这种信号复合体。3‘端非编码区依赖的信号复合体与G蛋白偶联受体CXCR4结合,通过配体结合后受体再循环的调控影响CXCR4的质膜表达。由于它被证明是CXCR4介导的B细胞迁移所必需的。所以3‘UTR依赖的信号复合体对CXCR4的募集也有生物学影响。另外,尽管在正常和恶性B细胞中观察到相似的总体BIRC3 mRNA水平,但BIRC3-LU在恶性B细胞中相对BIRC3-SU上调。这种上调被认为促进了白血病细胞在体内的存活,因为依赖于CXCR4的B细胞迁移允许白血病细胞聚集在可以提供生存和增殖的骨髓上(bone marrow niches)。

最后,涉及E3泛素连接酶BIRC3-LU的3’UTR介导的蛋白质复合物的形成具有额外的功能,因为它控制了酶的底物特异性。RALA的翻译后修饰只能通过BIRC3-LU来完成,而不能通过BIRC3-SU来完成,因此底物修饰需要事先进行蛋白质相互作用。

9. 效应蛋白从3’UTR向蛋白的转移机理

关于超出氨基酸序列的蛋白质特征的遗传信息是如何从mRNAs传递到蛋白质的,目前还很大程度上还不清楚。但是从最近发现了在CD47LU和SET蛋白之间建立3‘UTR介导的相互作用来看。这一过程需要两个与富AU元素结合的RNA绑定蛋白:HUR和TIS11B。已发现此过程需要两个与富含AU的元素结合的RBP HuR和TIS11B。HuR的功能是招募SET,而TIS11B则创造了一个允许3’UTR介导的SET与CD47和其他膜蛋白结合的环境。TIS11B形成RNA颗粒,可丰富含有富AU元件的膜蛋白编码mRNA。TIS11B颗粒形成网状网,与内质网交织在一起。TIS11B颗粒和内质网之间的功能相互作用形成了一个亚细胞隔室,具有与细胞质不同的生物物理和生化环境。只有在这个特殊的隔室内才能形成不能在外面建立的特殊的蛋白相互作用。这个隔室使3‘UTR介导的SET与CD47-LU以及其他膜蛋白相互作用。此外,这些研究表明,由于因为它们调节功能相关的3‘UTR介导的PPI的形成。富AU元件除了控制蛋白质丰度之外,还有其他作用。

10. 3’UTR顺式元素通常重复出现,并且经常协同作用

3‘UTR顺式元件有几个共同特征。通常,一个motif只需要3-8nt就可以结合RBP。这样的短基序经常在给定的mRNA中多次出现,并可以协同甚至合作的方式发挥作用。

顺式元件的确定对于鉴定绑定和介导特定3’UTR功能RNA绑定蛋白是很重要的。一般来说,顺式元件是使用缺失结构来进行确定的。然而,通常情况下,整个3‘UTR的表型效应不能用3’UTR的分离部分来概括。例如:Oskar mRNA的翻译调节元件和HMGA2 3‘UTR中的抑制元件上。为了鉴定2800个核苷酸长的HMGA2 3‘UTR中能够完全概括对蛋白质编码的抑制作用的元件,我们测试了一大组3’UTR片段,但没有一个片段具有全部活性。最后发现,3个3‘UTR亚区的协同作用是充分抑制功能所必需的。

除了富AU的元素外,许多其他的顺式调控motif也是已知的,包括那些被IGF2BP1,Pumilio,PTB和MBNL结合的motif。但是,富AU元件是发现的第一个顺式元素,仍然是研究最广泛的元素。

11. 与细胞系相比,原代细胞对3’UTR异构体表达的调控更大

由于3’UTR异构体比率会受到信号通路的持续性影响。因此,当原代细胞或组织与细胞系比较时,原代细胞在3’UTR异构体的表达上表现出明显更大的变化也就不足为奇了。除了改变的数量,在原代细胞中改变的幅度更高。在内含子中也可以发生选择性切割和多腺苷基化,并且内含子多腺苷酸信号的识别在原代细胞中比在细胞系中发生得更频繁。因此,原代细胞有利于促进的选择性切割和多聚腺苷酸的形成。

由于3’UTR异构体的细胞样本的天然的特异性,所以在进行分析之前将细胞先进行分选然后再定量的方法比在复杂的组织样本中进行定量更好。如果不能选择细胞分选,那么最近开发了cTagPAPERCLIP来测量完整组织中特定细胞类型的3’UTR亚型表达是一个很好的方法。这种方法基于与绿色荧光蛋白(GFP)标记的poly(A)结合蛋白(PABP)相关的mRNA 3’末端的co-IP实验,该方法要求小鼠以组织特异性的方式表达标记的PABP。

细胞系和原代细胞之间的代谢差异不仅会导致3’UTR亚型的差异,还会改变miRNA和富AU的元素的调节作用。为了使miRNA抑制靶mRNA的表达,需要将它们装载到一个兆达尔顿大小(megadalton-sized)的复合物中,称为RISC(RNA诱导的沉默复合物)。在细胞系和增殖细胞中,大多数miRNA存在于这些大型复合物中。但是,在原代细胞中,大多数miRNAs与RISC的一个组件Argonaute结合,Argonaute属于RISC的一部分但不是主要的一部分。主要的RISC复合体的组装是由信号转导途径(包括PI3K途径)的激活介导的。因此,在原代细胞中,miRNA仅在途径激活后才能够抑制其靶标(La Rocca等人,2015)。该原理可能对RBP的功能适用,因为信号传导途径可能影响蛋白质复合物的形成。

12. 3’UTR介导的体内调控

3‘UTR对整个生物体基因表达的强大作用已经在小鼠模型中得到了最好的证明。的第一个例子是c-fos转基因小鼠。当含有内源性3‘UTR和多聚腺苷酸信号的c-fos cDNA在强启动子中表达时,未检测到mRNA的表达。然而,在用逆转录病毒长末端重复序列取代3‘UTR后,在整个组织中观察到高mRNA表达。因此,c-fos 3‘UTR是体内抑制c-fos蛋白产生所必需的。

在许多其他小鼠模型中,采用了该原理,因为基因是从其内源性启动子表达的,但是其3’UTR和聚腺苷酸化信号却被强的聚腺苷酸化信号取代。尽管可以在这些小鼠中评估3’UTR对表型的影响,但研究人员需要意识到,所产生的表型是通过3’UTR 顺式反应元件的缺失和通过更有效的mRNA加工而导致的蛋白质而表达而产生的。编码Camk2a蛋白激酶的基因产生一个短的和长的3‘UTR亚型。用单一的强多聚腺苷酸信号替代这两种异构体可以阻止Camk2a mRNA定位于海马神经元的树突。这损害了长期记忆的形成,因为树突状mRNA的定位和局部蛋白质的产生是记忆巩固所必需的。神经营养因子BDNF也是由具有短或长3‘UTR异构体的mRNA编码的。BDNF在海马神经元中表达,完全破坏长3‘UTR亚型导致记忆形成受损。BDNF也在下丘脑神经元中表达,这些细胞中长3‘UTR亚型的破坏导致了严重的肥胖和神经元中BDNF的完全敲除。

另外生长因子、神经营养因子和酶的3‘UTR功能已经在小鼠中进行了研究,其中就包括转化生长因子β1、胶质细胞源性神经营养因子和醛固酮合成酶。研究的表型范围从器官异常、血压升高到胚胎死亡不等。这些实验表明,使用不同的3‘UTR可以使特定的蛋白水平改变100倍,这使得生成具有渐变mRNA表达水平(正常水平的10%至900%)的小鼠成为可能。如果完整的基因敲除导致胚胎致死的话,那这个方法就这特别有用了。

13. CRISPR技术为研究细胞系和生物体中的3’UTR异构体特异性功能提供了便利

从小鼠的3’UTR研究中,我们获悉,保持内源性启动子和聚腺苷酸化信号的调控应是研究重点。此外,尽管到目前为止,尽管迄今为止主要使用标记的3‘UTR异构体过表达构建体来研究3’UTR异构体的功能。然而CRISPR技术使得在内源性位点对细胞系和动物模型中的3‘UTR亚型进行更复杂的操作成为可能。

在下面的段落和图3中,显示了使用CRISPR技术研究3‘UTR功能的实验方法。如果一个基因产生替代的3‘UTR,并且只对长3’UTR亚型的功能感兴趣,那么图3A中所示的策略是有用的。在实验装置中,比较了以下细胞系或小鼠:(1)野生型,(2)CRISPR介导的蛋白质通过在编码区增加移帧而中断,(3)针对长3‘UTR异构体的短发夹状RNA(ShRNA)的稳定表达,以及(4)对照shRNA的稳定表达。这种方法被用来研究CD47-LU和BIRC3-LU的功能,如果长3‘UTR亚型在低水平表达最合适,因为它的敲除不会对总体蛋白质水平产生太大变化。

然而,如果长3‘UTR异构体在一定程度表达,并且需要保留总体蛋白表达水平,则可以使用图3B所示的Modified策略。将(1)野生型和(2)蛋白敲除产生的表型与仅表达(3)短或(4)长3‘UTR亚型的细胞系或动物进行比较。为了获得仅表达短3‘UTR异构体的细胞,使用一对引导RNA(guide RNAs)来删除近端和远端多聚腺苷酸信号之间的序列。这使远端多聚腺苷酸信号接近近端多聚腺苷酸信号,并在mRNA处理保持完好的情况下保持整体蛋白表达。为了获得只表达长3‘UTR异构体的细胞,近端的多聚腺苷酸位点可以被删除(使用一对引导RNA)或被点突变(point mutations)破坏。由于 3‘UTR缺失也会影响位于基因3’端的DNA调控元件,在实验中包括包含编码区和短或长3‘UTR异构体的带标签的cDNA构建物是有用的。这些结构的表达将使观察到的表型得以挽救,并确保表型确实是由3‘UTR引起的,而不是由DNA调控元件的缺失引起的。

为了研究具有单一3‘UTR异构体的基因的3’UTR的调节作用,可以将野生型和蛋白质敲除与CRISPR介导的3‘UTR缺失的细胞系或动物进行比较(图3C)。在这种情况下,使用一对引导RNA来删除终止密码子和多聚腺苷酸信号之间的3‘UTR序列。然而,位于聚腺苷酸信号上游的mRNA100核苷酸序列应该被保留,以便能够从内源性聚腺苷酸信号中进行适当的∼处理。

通过转染反义吗啉来改变mRNA的加工也可以改变3‘UTR亚型的表达。现在这个方法已经用于可变剪切当中可变外显子的纳入和排除。同样类似的,可变的多聚腺苷酸位点可以用来修饰改变替代的3‘UTR异构体比率。

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