肿瘤免疫微环境多样性之胃食管腺癌免疫治疗未来可期

1. 简介
胃食管腺癌(Gastroesophageal adenocarcinomas,GEA)是一种具有不同分子亚型的异质性癌症,一般分为四种亚型:严重发炎的微卫星不稳定亚型(microsatellite instability,MSI)及EB病毒阳性亚型( Epstein-Barr Virus,EBV),这两种亚型对于免疫检查点抑制剂( immune checkpoint inhibitors,ICI)有较好的反应(翻译成白话就是,ICI这种治疗方式对这两种病人的治疗效果比较好)
另外两种亚型为弥漫性基因组稳定型亚型(diffuse/genome-stable,GS)及染色体不稳定型亚型(chromosomal instable,CIN),这两种亚型则对于免疫检查点抑制剂(ICI)的反应比较差。为了促进免疫治疗,就很有必要探究一下这些亚型之间及亚型内部免疫浸润的差异。

2020年5月6日,丹娜法伯癌症研究院Adam Bass团队在Annals of Oncology上发表了题为Characterizing diversity in the tumor-immune microenvironment of distinct subclasses of gastroesophageal adenocarcinomas的研究,报道了GEA不同免疫亚型之间的差异,大多数GS亚型因为拥有三级淋巴结构(tertiary lymphoidstructures,TLSs)而更有可能适用于免疫疗法(答疑时刻:三级淋巴结构,是一种异位的淋巴器官,存在于包括肿瘤在内的非淋巴组织的慢性炎症部位,一般和预后存在正相关且有较好的免疫治疗反应,是癌症免疫治疗新途径)
大多数CIN亚型显示出T细胞排斥和巨噬细胞浸润,且免疫较差的CIN亚型存在MYC活性和CCNE1基因扩展(答疑时刻:MYC是较早发现的一组癌基因,;CNE1基因扩展被认为是增加非整倍体的刺激因子,而非整倍体性是一种肿瘤特征,所以,你懂得~~)
2. 材料和方法
1)病人数据:
(1)TCGA数据:包含EBV亚型 (n=30), MSI 亚型(n=75), CIN亚型 (n=297), 以及 GS 亚型(n=51)。
(2)FFPE样品:即福尔马林固定后石蜡包埋的组织,包含CIN亚型 (n=26) 和GS 亚型(n=18) ,MSI 亚型(n=14) 和EBV亚型 (n=13) 。
2)免疫组化及免疫分析
(1)数字化免疫细胞分析:可分别分析肿瘤边缘和肿瘤中心的免疫细胞(每mm2细胞数或染色强度)。
(2)NanoString mRNA表达分析:对FFPE样本提取RNA并做表达量分析(答疑时刻:2008年《NatureBioteehnology》杂以封面文章形式报道了NanoString技术,此技术自动化程度高,反应中无需酶逆转及扩增的过程,避免了相关偏差,其检测敏感性、准确性和实时荧光定量PCR技术相当,但是通量相对更高,一个体系可以进行超过800个杂交反应~~换句话说,在准确性上KO芯片和高通量测序,在通量上KO定量PCR,就是不知道价格香不香?)。
(3)基因组测序CIN亚型样本进行包含243个基因的目标区域靶向测序。
(4)计算机分析:基于TCGA数据,使用TIMMER预测CD8+ T 细胞, CD4+ T 细胞, B 细胞, 巨噬细胞, 中性粒细胞和树突状细胞 (dendritic cells,DC),使用聚类分析CD8及 CD4 scores来区分免疫冷热状态(hot and cold status)。
(6)基因组注释:计算非整倍体分数,包含染色体臂水平的以及拷贝数变化。用GSEA对数据集进行注释。
3. 结果展示
1)GEA不同亚型之间的免疫浸润存在显著差异
为了评估不同亚型GEA的免疫相关肿瘤微环境,对TCGA数据进行了TIMMER分析,预测了CD8+ T 细胞, CD4+ T 胞, B 细胞, 巨噬细胞, 中性粒细胞和树突状细胞 (dendritic cells,DC)的丰度,结果发现EBV亚型富含CD8+ T 细胞,而GS 亚型富含CD4+ T 细胞, B 细胞, 巨噬细胞,而CIN亚型所有的细胞类型相对含量都很低(这可能就是CIN亚型对免疫疗法不感冒的原因吧)
作者大概是怕有杠精怀疑他的生信分析结果,基于自己的组织切片样本,(1)通过免疫细胞计数发现MSI 亚型和EBV亚型的CD8+ T 细胞的密度较高,而免疫治疗效果不理想的CIN亚型和GS 亚型相对密度较低(来了一记实锤哦~)
(2)空间免疫组学发现EBV亚型的CD8+ T 细胞主要集中在肿瘤中央,而CIN型的CD8+ T 细胞主要集中在肿瘤的边缘部位(也就是说,对CIN亚型用免疫疗法,只能在边上小打小闹,根本攻不进肿瘤的核心区)(实锤+1)。
(3)结合临床治疗效果,发现较好的PD-L1治疗效果总是伴随着较高的CD8+ T 细胞密度(实锤+2)
截止到现在为止,还一NanoString mRNA表达分析的数据没用上,不能白做呀~~作者用这部分数据给所有样本做了个聚类分析,发现GS 亚型和EBV亚型以及许多MSI 型比较接近,而一半的MSI 亚型被聚到炎症反应较少的那个分支去了,这意味着MSI 亚型内部没有统一起来,存在异质性,且两个分支不存在年龄、性别、取样部位、CD8+ T 细胞丰度上的差异(事情的复杂度升级了,interestingly)
鉴于CIN亚型和GS 亚型对于免疫检查点抑制剂(ICI)的反应比较差,作者决定迎难而上,就把这篇文章剩余的火力都给集中在这两种亚型上了。

2)CIN亚型存在异质性的免疫微环境
对CIN样本单独进行聚类发现,该亚型可以进一步分成两类,一类是炎症反应相对强烈的CIN-hot组以及对立的CIN-cold组,而上述我们提到过的免疫组织切片、数字化分析、免疫细胞位置的结果也支持这种分组结果。
小组分好了,接下来就是找茬了,看看差异的点到底在哪。
3)CIN-hot组和CIN-cold组的基因组差异分析
还记得我们在方法部分提到的,对CIN亚型样本进行包含243个基因的目标区域靶向测序,就是在这部分起作用的,作者发现MYC基因的扩张伴随着CD8+ T 细胞和CD4+ T 细胞的减少(此强彼弱,结果就是朝着癌症的方向前进)。

随后,扩大样本量,用TCGA的数据分析一下。基于CD4和CD8的丰度值,也能够分成CIN-hot组和CIN-cold组,这两组在性别、年龄、肿瘤分期、生存预后上没差别,but 在地理上有差别,比如亚洲和巴西的一般是CIN-hot组。

 

4)CIN-cold组富集到了细胞周期调控通路
为了识别T细胞排斥的潜在调节因子,用GSEA分析了TCGA数据中CIN-hotCIN-cold组的差异基因。与预期相符,CIN-hot组富集到了炎症反应相关通路,而CIN-cold组富集到了细胞周期调控与增值,比如MYC基因的靶通路。拷贝数分析发现,细胞周期调控因子CCNE1基因在更多的CIN-cold组中存在拷贝数变化,且拷贝数变化与CD8的丰度负相关。
(关于CIN亚型的探索到此结束,接下来该唠一唠GS 亚型了)
5)GS 亚型富含三级淋巴结构
通过切片观察,作者发现GS 亚型中的CD8+ T 细胞聚集结构非常像三级淋巴结构(忘记这是什么的同学,请往上翻~),免疫组化和NanoString分析验证了这一推测,这也使得GS 亚型患者有望在未来的日子里可以使用免疫疗法。

通篇看下来,深深折服于作者的思维缜密和旁征博引;今天的文章解读就讲到这,下次继续。。。。。。
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