RAS超家族关键成员RhoA蛋白是细胞内重要的调控因子，在细胞骨架重构、细胞周期进程、细胞侵袭迁移以及基因表达等方面都具有重要的调控功能作用。Rho家族蛋白在肿瘤恶性增殖和转移中的重要功能，使其成为抗肿瘤药物研发领域的重要药物靶标[1-3]。人们长期致力于发现靶向Rho蛋白的小分子药物，但是由于该家族蛋白本身是一个球形结构，除了GDP/GTP结合位点外无明显化合物作用口袋；而底物GDP/GTP与蛋白本身的结合非常强（结合强度在pM级），因此很难将底物从口袋竞争出去，这就导致传统的药物研发方法难以发现直接靶向Rho家族蛋白的抑制剂。现有的靶向Rho家族蛋白的小分子抑制剂屈指可数，骨架结构单一，活性和选择性均不理想，至今尚未有进入临床的化合物[4]。因此，用新的方法及策略发现靶向性Rho家族抑制剂迫在眉睫。
2020年5月13日，中国科学院上海药物研究所罗成研究组、复旦大学党永军研究组、哈尔滨工业大学刘川鹏研究组以及广州中医药大学刘博研究组合作在Advanced Science上在线发表题为“Covalent inhibitors allosterically block the activation of Rho family proteins and suppress cancer cell invasion”的研究论文。该研究报道了首个靶向RhoA蛋白的共价变构抑制剂，发现该蛋白的新型变构调控口袋，阐明其变构调控机制，为后续抑制剂的开发改造奠定基础。
在该项研究中，首先，文章作者通过分子动力学模拟开展RhoA蛋白动态机理研究，发现位于Cys107附近的一个可结合小分子的变构“口袋”，并且该位置附近S188位点可被磷酸化修饰，从而抑制RhoA蛋白的活性。由此，推测该变构口袋是个可被共价化合物结合的功能型口袋。经过共价对接，并结合体外RhoA活性筛选平台，发现了苗头化合物DC-Rhoin，该化合物体外可抑制GEF-LARG催化RhoA底物GDP/GTP的交换过程，其IC50值为2.94±0.34 μM。接着，利用核磁共振分析和质谱技术证实DC-Rhoin与RhoA的Cys107残基共价结合，并利用体外Pull Down实验证实化合物通过结合在RhoA蛋白的Cys107残基上，可以选择性地破坏其与调控蛋白RhoGEF及RhoGDI的相互作用，基本不影响与RhoGAP的相互作用。由于Cys107位点只在Rho家族蛋白内保守，在RAS超家族其他成员中基本不存在，因此DC-Rhoin对RAS超家族其它成员中具有较好的选择性。
为了进一步探索DC-Rhoin与RhoA蛋白的结合模式，并阐明该化合物选择性破坏RhoA与GEF及GDI相互作用的分子机制，文章作者又解析了DC-Rhoin与RhoA蛋白的高分辨率复合物结构。从晶体结构上可以看出化合物通过共价结合在Cys107残基上，可以引起远端67-74位残基发生极大构象改变，并稳定捕捉到新型口袋“CLocK”。而RhoA蛋白67-74位残基处在与RhoGEF-LARG、RhoGDI的相互作用界面上，而不在与RhoGAP-ARAP3互作界面上，阐明了DC-Rhoin选择性破坏RhoA与其调控蛋白相互作用的分子机制。
接着，文章作者经过化学改造，得到了活性更好的化合物DC-Rhoin04，并且在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞上验证了该系列化合物在细胞内对RhoA信号通路的抑制作用，并证实该类化合物在细胞内通过结合在RhoA Cys107位点上可以减弱肿瘤细胞的迁移及侵袭能力。
综上所述，该研究工作中发现的新型变构口袋“CLocK”为Rho 家族蛋白的靶向性药物开发奠定基础。此外，该研究基于Rho家族蛋白依赖互作蛋白调控、存在变构调节等特点，采取靶向变构调控、PPI界面的计算模拟与实验筛选相结合的方法，高效实现其先导化合物的发现，该方法可为其他“难以靶向”蛋白的抑制剂开发提供借鉴作用。
图3. DC-Rhoin作用模式示意图
据悉，中国科学院上海药物研究所罗成研究员、复旦大学党永军教授、哈尔滨工业大学刘川鹏副教授以及广州中医药大学刘博研究员为该论文的共同通讯作者；中国科学院上海药物研究所与哈尔滨工业大学联合培养博士研究生孙中雅、中国科学院上海药物研究所张豪博士、张元元副研究员、博士研究生廖丽萍以及广州中医药大学博士研究生周文为该论文共同第一作者。该研究得到了上海药物研究所陈凯先院士、蒋华良院士、周兵研究员、张乃霞研究员及谭敏佳研究员的支持。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202000098
参考文献：
[1] Wilson, K.F., Erickson, J.W., Antonyak, M.A. & Cerione, R.A. Rho GTPases and their roles in cancer metabolism. Trends in Molecular Medicine 19, 74-82.
[2] Cook, D.R., Rossman, K.L. & Der, C.J. Rho guanine nucleotide exchange factors: regulators of Rho GTPase activity in development and disease. Oncogene 33, 4021-4035 (2014).
[3] Sahai, E. & Marshall, C.J. RHO–GTPases and cancer. Nature Reviews Cancer 2, 133 (2002).
[4] Lin, Y. & Zheng, Y. Approaches of targeting Rho GTPases in cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery 10, 991-1010 (2015).
