自从 2013 年 CRISPR-Cas9 基因编辑技术横空出世，便以其易用性和普适性迅速风靡整个科研界。目前通过 CRISPR-Cas9 介导的常规基因敲除和外源 DNA 精准插入在疾病相关突变修复、动植物产量提升等方面展现出不可限量的应用潜质。
CRISPR-Cas9 介导基因编辑的两种机制
正如开篇所言，使用 CRISPR-Cas9 在各种生物系统中实现基因组特定位置上的高效编辑，为基因组学带来了革命性的突破。通过 CRISPR-Cas9 生成双链断裂后，哺乳动物细胞会通过内源性细胞机制修复断裂的位点，典型的机制包括非同源末端连接（NHEJ）通路和同源介导修复（HDR）通路 [1]。
这正是 CRISPR-Cas9 介导基因编辑的原理，当 CRISPR 体系切割产生双链断裂后（double-stranded break），细胞内 DNA 修复遵循以下两种机制：一是非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ），断裂 DNA 直接连接；另一种是同源定向修复 （homology-directed repair ，HDR），细胞依据 DNA 模板进行同源重组修复。
其中 HDR 不容易发生错配，能够精确复制相关 DNA 序列中的遗传信息，但是这个过程效率通常不高， 因此尽管在大多数生物学系统中 CRISPR 可以介导高效率的基因敲除，通过 HDR 通路实现外源片段的无缝插入依然富有挑战。[2~4]
基因编辑实验如何实现 HDR 效率的最大化
既然未来已来，作为实验者的我们如何顺势而为，最大化 HDR 率？
首先需要了解作为外源 DNA 供体的修复模板的类型、模板设计和 PAM 位点选择是如何影响 Cas9 介导的同源性修复（HDR）效率的；然后可以阅读链接的应用说明，获得逐步且详细的指导，以期在自己的基因组编辑实验中实现 HDR 效率的最大化。
众所周知，Alt-R® CRISPR-Cas9 基因组编辑系统由带有化学修饰的合成引导 RNA 以及来自化脓性链球菌的 Cas9 内切酶组成，这为成功的基因敲除提供了完整的解决方案。
结合定制化的外源修复模板，Alt-R 系统支持通过 HDR 通路实现快速灵活的基因插入或者替换；相比容易发生错配的 NHEJ 修复通路，HDR 通路的修复效率普遍较低，因此在实战中优化 HDR 的实验条件对于取得高效的 HDR 效率就显得尤为重要。
此外 HDR 的效率可能受到许多实验因素的影响，诸如选择的 PAM 位点、作为外源 DNA 供体的修复模板类型以及模板序列的设计等等，这些因素以及许多其他因素共同作用，导致在不同细胞系中观察到的 HDR 效率存在较大差异[5]，因此在实验过程中各类影响 HDR 效率的因素需要得到严格控制。
HDR 实验的设计考虑因素及实验流程
我们在这里简要总结了一下成功设计 HDR 实验的考虑因素，以便实现更为均一高效的结果，同时您还可以查看更详细的应用说明，这些说明以我们的内部研究为基础，提供了逐步指导，以便在您自己的基因组编辑实验中实现最高的 HDR 率。
1. HDR 实验的设计考虑因素
使用单链 DNA 作为修复模板，高效的 HDR 实验的工作流程示例如图 1 所示。
图 1
HDR 通过序列同源性交换 DNA 序列信息：即修复模板中包含所需插入片段，修复模板的两端则是与插入位点附近具有序列同源性的重组臂。过去通常使用双链 DNA（dsDNA）作为修复模板，但最近的研究揭示了单链寡核苷酸脱氧核苷酸（ssODN）作为 HDR 供体模板的优越性。
ssODN 对同源重组臂的长度要求较短，同时相比类似的 dsDNA 修复模板，其提供的插入效率更高 [6,7]。作为寡核苷酸化学合成 的全球领导者，IDT 以 Ultramer® 寡核苷酸和 Megamer® 单链片段 两种形式向客户提供合成 ssDNA，两者均非常适合作为高保真修复模板用于基因编辑实验 [8]。
2. 选择合适的引导 RNA 以优化 HDR 效率
引导 RNA 的切割位点对 HDR 的效率具有显著影响，因此需要考虑每个可用的引导 RNA 的切割位点相对于突变引入位置（即插入位点）的距离。当插入位点距离切割位点较远时，HDR 的效率会急剧下降。
我们建议在插入位点周围选择并检测 2~4 个 CRISPR-Cas9 PAM 位点，选择最接近预期插入位点且切割效率最高的 PAM 位点，以便最大程度提高 HDR 的效率。
3. 合理设计 ssODN 修复模板
作为单链的修复模板，ssODN 既可以设计为与靶向链（targeting strand）进行结合，也可以设计为与非靶向链 (non-targeting strand) 进行结合。我们建议在条件允许的情况下尽可能的对这两种可能的模板序列都进行测试。我们在使用 Ultramer 寡核苷酸进行小片段插入时（如碱基替换、标签插入），发现单侧 30~60 个碱基的重组臂设计可以获得高效且稳定的 HDR。此外，我们发现与对称设计相比，使用非对称设计的 ssODN 模板并不能稳定的提升 HDR 效率。
综上所述，我们建议将所需突变/插入片段置于 ssODN 修复模板的中心位置，在其两侧设计加入 30~60 个碱基的与目标位点具有序列同源性的重组臂。
4. 在修复之后，避免重新创建 PAM 序列
在实验条件允许的情况下，我们可以在设计 ssODN 模板序列时考虑将无义突变引入引导 RNA 的结合区域，甚至可以考虑突变 PAM 位点本身。这有助于防止在 HDR 完成后在插入片段附近重建 PAM 位点，避免修复后在同一位点的反复切割。
One more thing，在 Alt-R 基因组编辑系统中使用化学合成的引导 RNA，您可以避免 在体外转录 RNA 前耗时的克隆步骤，同时简化实验工作流程，通过精心优化的实验条件和专门设计的 ssODN 修复模板，您可以通过 HDR 通路获得所需的精确突变/插入。最后，如果您想获得更为详尽的关于 Alt-R CRISPR-Cas9 产品最大化 HDR 效率的实验指引，可以在 IDT 网站上搜索查看完整的 HDR 应用说明。
学习一下这个技术