孔旭东等开发高效筛选口服多肽药物策略

相比于小分子药物,多肽药物在亲和力,专一性和代谢毒性等方面都有着突出的优势。随着2019年口服索马鲁肽的上市,口服多肽逐渐受到了全球生物医药研发领域的广泛关注。实现活性多肽的口服给药是多肽药物领域多年来难以克服的巨大挑战。

目前已批准上市的70多种多肽药物中仅有6种可口服给药。多肽类分子的口服给药主要存在两个限制因素:1)易被胃肠道中蛋白酶降解;2)在小肠中吸收效率低。提高多肽在胃肠道蛋白酶环境中的稳定性是实现口服多肽药物开发的基础。传统口服多肽药物的开发通常从天然来源的活性多肽分子出发,通过结构改造提高其在蛋白酶环境中的稳定性。然而该策略无法获得全新结构的多肽分子(不适用于新的药物靶标),并且很难在不影响药物活性的情况下提高稳定性。

为了解决上述问题,2020年5月11日,来自洛桑联邦理工学院(EPFL)的Christian Heinis课题组(论文第一作者为孔旭东博士)Nature Biomedical Engineering杂志上发表了文章De novo development of proteolytically resistant therapeutic peptides for oral administration 该论文通过结合噬菌体展示双桥肽 (double-bridged peptides) 技术和蛋白酶选择压力,实现了针对特定靶标高效筛选能耐受蛋白酶降解的多肽分子,用于口服多肽药物开发。

噬菌体展示的双环肽技术 (Phage display of bicyclic peptide) 是由Gregory Winter爵士和Christian Heinis教授于2009年开发的环肽类药物筛选平台Nat. Chem. Biol., 2009, doi: 10.1038/nchembio.184。基于该平台的多肽药物开发公司Bicycle therapeutics于2019年在美国纳斯达克上市)

在此基础上,Heinis课题组于2018年发表了第二代噬菌体展示双环肽结构——双桥肽 (Nat. Chem., 2018, doi: 10.1038/s41557-018-0042-7)。其原理是将带有四个半胱氨酸的线性多肽展示到噬菌体表面,利用两分子化学试剂 (图中L) 分别修饰两对半胱氨酸后形成双桥肽结构。噬菌体展示双桥肽技术的基本流程是,在大肠杆菌中表达和组装表面展示有线性多肽(其中包含四个Cysteine)的噬菌体颗粒。对纯化后的噬菌体肽库进行化学修饰以获得双桥肽库,利用磁珠固定的靶标蛋白从库中富集与之特异性结合的多肽分子。最后将富集的噬菌体颗粒通过侵染(infect)大肠杆菌进行扩增,提取噬菌体DNA后通过测序获得相应的多肽序列。

为了获得能够耐受蛋白酶降解的多肽分子,研究人员设计了结合稳定性筛选与亲合筛选的协同筛选策略。即先将噬菌体双桥肽库暴露于蛋白酶环境中(本文采用了提取自猪胰腺的Pancreatin来配制模拟人类小肠蛋白酶环境的标准溶液SIF,simulated intestinal fluid),将其中稳定性较差的多肽进行降解。然后将剩余的具有较高稳定性的双桥肽库用于靶标蛋白的亲和筛选,从而获得同时具有高稳定性和高亲和力的多肽分子。

然而,Heinis组在之前的研究中为了兼容对多肽中半胱氨酸进行的化学修饰,选用的噬菌体含有缺失了6个半胱氨酸(三对二硫键)的P3蛋白突变体。该突变体的使用不仅导致了噬菌体对大肠杆菌的侵染活性下降了100倍,还造成了噬菌体无法耐受SIF中蛋白酶的降解(https://doi.org/10.1093/protein/gzs085)。因此为了实现噬菌体筛选与蛋白酶选择压力的兼容,研究人员首先利用双环肽PK15作为模式分子对多肽在噬菌体表面的化学修饰条件进行了优化,实现在抗蛋白酶降解的野生型丝状噬菌体fd phage的表面进行双桥肽的修饰。修饰后约90%的噬菌体将失去侵染活性,但剩余的活性噬菌体仍足以满足后续筛选的需要。

研究人员基于fd phage构建了长度为9至14个氨基酸的噬菌体多肽库,总的序列多样性达到2 × 1010。经10种化学交联剂修饰后可获得结构多样性为 6 × 1011 (6千亿) 的双桥肽库。以Factor XIa作为靶标,在1-10% SIF蛋白酶选择压力作用下进行五轮筛选后,研究人员成功富集了能够以高亲和力抑制靶标蛋白活性 (Ki = 19 ± 2 nM),同时能耐受SIF中蛋白酶降解 (在100% SIF中t1/2 = 3 h) 的双桥肽分子F3。并且利用NGS(二代测序)对多肽在每轮筛选过程中的富集进行分析后发现,施加蛋白酶选择压力可显著提高具有更高稳定性的多肽序列的富集。

通过affinity maturation,研究人员获得了F3的类似物F19,进一步提高了其亲和力 (Ki = 0.9 ± 0.1 nM) 和稳定性 (100% SIF中t1/2 = 8.8 h) 。研究人员通过解析F19与Factor XIa的晶体结构发现该双桥肽分子以310-helix的二级结构结合于活性位点。但通过CD和NMR分析发现,F19在溶液状态下并不存在稳定的二级结构,因此根据其晶体结构无法解释其耐受蛋白酶降解的结构基础。研究人员进一步合成了线性以及单环状态等一系列F19类似物,结果表明F19的双环结构,其特定的氨基酸序列,以及所用化学交联剂的结构共同实现了它的高稳定性。这提示了高稳定性的双桥肽分子难以通过设计获得,体现了噬菌体展示技术通过对庞大多肽库的筛选实现稳定性进化的价值。

研究人员在小鼠中进行双桥肽F20 (F19类似物) 的口服药代动力学测试,结果表明 F20 能相对稳定地存在于小鼠胃肠道中。在给药后 2 小时后仍可在肠道中检测到超过30%的F20,并有少量 F20 被吸收后进入血液(生物利用度bioavailability = 0.26%)。虽然F20较差的吸收效率导致其生物利用度不足以实现口服给药后对Factor XIa活性的有效抑制,但这一策略为开发口服有效的活性多肽提供了更高的起点。同时这一创新策略也为开发靶向胃肠道疾病的口服多肽药物打开了一扇新的大门。作为验证,研究人员最后对炎症性肠道疾病(IBD)的药物靶标白介素23受体进行了类似的筛选,获得了亲和力为210 nM并能在SIF稳定存在(t1/2 = 4 h)的双桥肽抑制剂。

这项研究表明,通过在噬菌体筛选中施加蛋白酶选择压力,可针对特定靶标高效地筛选能够耐受胃肠道极端蛋白酶环境的双桥肽分子。后者可作为开发口服多肽药物的先导化合物。这一策略基本解决了口服多肽药物中稳定性差的限制,为开发在胃肠道局部发挥作用的口服多肽药物提供了新的机会。

原文链接:https://doi.org/10.1038/s41551-020-0556-3
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