骨髓纤维化 (Myelofibrosis, 骨纤) 是一种严重的骨髓增生性肿瘤 (myelo-proliferative neoplasm, MPN)，与MPL-JAK-STAT途径的体细胞突变密切相关 (主要由JAK2, MPL, CALR突变引起），群体中发病率约为十万分之五，属于罕见性疾病。其主要症状包括巨核细胞 (Megakaryocyte) 增多、贫血、脾肿大等，部分患者会发展为急性髓系白血病 (acute myeloid leukemia, AML）。
图 | 骨髓纤维化
临床研究发现，骨髓纤维化多发生于老年人。目前唯一有效的治愈方法为骨髓移植，但由于骨髓移植条件严格，真正能够通过骨髓移植得到治疗的病人数量极少。此外，由于对巨核细胞导致纤维化的理解还不够深入，治疗骨髓纤维化的药物还不能从根本上改善生存率，导致这一疾病的生存时间仅为5-10年。
骨纤病人的主要疾病特征之一是骨髓出现纤维化，形成“结痂”，造血干细胞（HSPCs）向外周血动员，进入外周血中。利用这一现象，2020年5月7日，来自英国牛津大学Weatherall Institute of Molecular Medicine 研究所Adam Mead教授课题组、Bethan Psaila课题组和Supat Thongjuea课题组合作（Bethan Psaila博士和王冠琳博士为本文共同第一作者，王冠琳博士主要负责了单细胞组学工具开发、分析等工作）在Molecular Cell上在线发表题为“Single-Cell Analyses Reveal Megakaryocyte-Biased Hematopoiesis in Myelofibrosis and Identify Mutant Clone-Specific Targets”，对来自16位骨髓纤维化病人和年龄匹配的5位健康捐献者的总计超过13万外周血细胞 (CD34+ Lin- HSPCs) 进行了单细胞转录组测序，揭示了骨纤病人中巨核细胞异常的分化调控及其异质性。同时结合靶向单细胞突变分析(TARGET-seq)和单细胞CyTOF技术对潜在的免疫疗法位点G6B进行了验证。
首先，作者对来自骨纤病人和健康志愿者超13万单细胞转录组数据进行了分析。大规模单细胞转录组数据的整合一直是一个难点，如何在去除批次效应的基础上保持生物学差异。通过比较不同的整合方法，作者对120,196个质控后的细胞采用ComBat算法进行整合，在降维和无监督聚类分析后，通过特征基因注释，将细胞分成了八个亚群。
研究发现，和健康捐献者相比，表达巨核细胞特征基因的HSPCs主要来自于骨纤患者。由于来自骨纤病人的细胞数要大于健康捐献者的细胞数，作者们进一步创建了一个骨纤病人和健康捐献者相同细胞数的数据集，对不同谱系的细胞群进行了比较，结果发现超过93%的巨核细胞（MkP）和不到10%的淋巴细胞（Lymph）来自于骨纤病人。与此同时，通过结合分化轨迹分析，作者们发现来自骨纤病人的巨核细胞出现了独特的分化途径。
为了确定骨髓纤维化中异常巨核细胞的分化过程，作者使用Scanpy软件包对骨纤病人的HSPCs的分化进行了轨迹分析，表明巨核细胞分化的独特轨迹是从造血干细胞起源的。对1639个转录因子的表达模式分析确定了在巨核细胞 (MkP) 和红系 (Ery) 分化轨迹上出现变化的转录因子: 例如已知的参与巨核细胞与红系谱系转录因子GATA1、GATA2的表达增加；巨核细胞-红系细胞命运决定FLI1和KLF1的两个关键调节因子的拮抗表达。作者还发现了一些新的可以作为巨核细胞-红系分化的调节的关键因子，包括YBX1、HMGA1、PLEK、SOX4和MYC等。
骨纤病人的巨核细胞和健康人群的巨核细胞是否有差异呢？作者对骨纤病人和健康捐献者的巨核细胞（MkP）进行了差异分析，显示骨纤病人MkP中代谢途径 (包括氧化磷酸化、脂肪酸代谢) 和炎症途径等显著富集。此外，对MkP异质性分析发现，来自骨纤病人MkP的一个子集显示了与健康捐献者MkP相似的基因表达谱。而大部分骨纤病人MkP具有独特的基因表达谱，这表明骨髓纤维化中巨核细胞诱导的纤维化是很可能是异常巨核细胞的扩增导致的。
同时，作者们还对此前被认为仅在成熟巨核细胞表面G6B蛋白，进行了验证分析。单细胞转录组发现G6B（MPIG6B基因）除了在巨核细胞中高表达，在其他谱系中也有表达，这表明G6B可能在骨纤病人造血干细胞分化的早期就已经有表达。通过使用靶向单细胞突变TARGET-seq分析，在靶基因测序的同时测定转录组，对同一患者体内的癌细胞（存在突变的细胞）和健康细胞（没有突变的细胞）进行直接比较，发现G6B（MPIG6B基因）在患者的癌细胞中表达明显高于相同患者的健康细胞或健康捐献者的细胞。同时，作者们还通过单细胞CyTOF进行了20种表面蛋白的测定，在骨纤患者以及MPN细胞系中始终可以检测到较高水平的G6B，而在其他白血病细胞系中则未检测到。
通过结合单细胞多组学的方法，该项研究为进一步研究骨髓纤维化病人的的潜在机制提供了线索，同时也展示了单细胞多组学分析在发现、验证疾病新靶点中的重要作用。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.04.008
