SARS-CoV-2检测的主要手段是RT-qPCR的方法,但是该方法依赖于特定的试剂和仪器。其他不依赖于RT-qPCR的方法仍需要比较复杂的操作步骤。最近,基于DNA等温扩增的方法已经被提出,比如LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)的方法[1],但该方法可能存在非特异性的扩增。而其他一些基于CRISPR的检测方法,比如SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)[2],虽然特异性高,但是需要两步反应。
2020年5月5日,张锋及合作者团队再次发布了新的SARS-CoV-2检测方法。这个简称STOPCovid(SHERLOCK Testing in One Pot)的方法把LAMP和SHERLOCK合并进行,灵敏度与RT-qPCR相当。该方法适用于唾液或鼻咽拭子样本,每个反应的检测下限为100个RNA拷贝。
图1. STOPCovid方法的基本流程和所需的设备
首先,研究者设计了一组引物,用于LAMP反应以扩增SARS-CoV-2的N基因。LAMP反应在相对较高的温度下进行(~60℃)(图2),为了把LAMP和SHERLOCK合并在一个体系,Cas酶要在该温度下稳定且保留足够的活性。此次实验者选择了来自Alicyclobacillus acidiphilus的Cas12b(AapCas12b)。而且,加入牛磺酸(taurine)对反应有促进作用。
STOPCovid不会对SARS-CoV或者MERS-CoV产生交叉反应。研究者也用阳性患者或健康人的鼻咽拭子样本验证了该方法的可靠性。因为用于裂解病毒颗粒的QuickExtract含有蛋白酶K,裂解后的反应可能还要加入蛋白酶K抑制剂。如果第一步的裂解反应选择95℃孵育5分钟,则蛋白酶K会被灭活,不需要加入抑制剂。
图2. STOPCovid的三步反应
最后,科学家们也提出,STOPCovid反应可以被包装在一个低成本的模块化试剂盒中(图3),进一步简化流程,使病毒检测可以在不同的条件下得到应用,如医院、测试站,办公室和家里。密封的试剂盒将降低污染的风险,还可以结合手机app来分析图像,展示测试结果。
图3. 可以容纳STOPCovid反应的模块化试剂盒