文献解读:m6A RNA甲基化研究思路

今天讲一讲非编码RNA之后炙手可热的明星——m6A RNA甲基化,m6A是指腺嘌呤的第6位氮原子发生甲基化修饰,进行“书写”(Writer)、“擦除”(Eraser)或“阅读”(Reader),从而对RNA产生调控作用。

本次解读文献来自Nature子刊Nature Cell Biology(IF:17.7)题目为“Recognition of RNA N6-methyladenosine by IGF2BP proteins enhances mRNA stability and translation”,我们一起来领略顶级期刊的风采。

           

m6A是真核生物mRNA上最普遍的修饰,但其在行使功能时需要特定的阅读蛋白介导,比如著名的YTH家族蛋白等。首先研究团队通过之前的研究工作发现。

在YTHDF2介导的m6A途径中,有这样一种情况:当mRNA上的m6A含量降低时,mRNA的含量并未升高,反而显著降低,这表明应该存在另外的阅读蛋白介导了m6A的功能。

           

接着研究团队用RNA pulldown实验结合质谱分析,发现IGF2BP蛋白显著结合在m6A上,表明它可能是m6A结合蛋白。接着通过数据库检索也证明了IGF2BP蛋白具有较强的m6A结合能力。

           

为了更加准确的说明是IGF2BP蛋白结合m6A,研究团队经过一系列测序实验和分析不仅证明表明IGF2BP的确是m6A的结合蛋白,而且发现IGF2BP蛋白主要通过识别并结合转录本的3’UTR处的m6A位点来进行读取。

           

研究团队随机选取了四个基因:MYC、FSCN1、TK1和MARCRSL1进行验证,发现在敲低或敲除甲基化酶METTL14降低m6A水平后,IGF2BP蛋白结合目的基因的能力发生显著下降。

           

接着研究团队机制探究基因表达降低与m6A修饰的关系,通过m6A-seq和RNA-seq等实验,发现敲低METTL3或者METTL14后,IGF2BP结合的目的基因表达显著降低,这些结果表明m6A介导了IGF2BP调控基因表达。

           

前面通过测序等手段,发现m6A介导了IGF2BP调控基因的表达,研究团队又以MYC为例,进一步验证m6A是否介导了IGF2BP对MYC的调控,发现IGF2BP是结合在mRNA的KH区域。

           

进一步研究人员又利用白质谱、免疫荧光等方法探究IGF2BP是如何调节mRNA稳定性,证实IGF2BP蛋白可招募HuR等蛋白来促进mRNA的稳定性。

      

最后团队放大招研究IGF2BP在癌症中的功能,TCGA数据库显示,IGF2BP在癌症组织中高表达,表明IGF2BP可能具有促癌功能,于是实验团队通过敲低IGF2BP以及后期的一系列实验进行探究,实验发现IGF2BP表达降低后,HeLa、HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭显著降低。

           

最后的最后,研究团队利用Crispr-Cas9等技术对IGF2BP的促癌功能进行验证,通过实验证实IGF2BP1-3具有促进癌细胞增殖、迁移和侵袭的功能。

        

整篇文章,研究团队根据发现IGF2BP的表型进行挖掘,不断发现新现象并通过多种实验手段进行验证,反复挖掘不断验证,最终形成顶刊文章,文章中还有特别多的细节和难度实验像mRNA稳定性实验、Crispr-Cas9技术等,感兴趣的小伙伴可以阅读一下全文,结尾附一张简单的流程图。

           

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