上次跟大家一起学习了1篇脑卒中跟自噬相关的研究，比较简单，算是自噬研究的入门了，今天我们继续来看文献，今天解读的是一篇阿尔茨海默病相关的，同样是自噬，但是这篇文章把自噬跟NLRP3炎性小体结合起来了，而NLRP3炎性小体是介导细胞焦亡的关键，因此这篇文章也算结合了细胞自噬和焦亡2个热点。
这篇文章的题目是：Beclin1-drivenautophagy modulates the inflammatory response of microglia via NLRP3，Beclin1驱动的自噬通过NLRP3调控小胶质细胞的炎症反应。2019年发表在《The EMBO Journal 》杂志，当前影响因子是11.227。
先来看研究背景：
主要交待了几个方面的内容：
1.阿尔茨海默病（AD）的简介；
2.小胶质细胞在AD发病中的作用；
3.炎症与AD的关系，引出IL-1β和NLRP3。
4.AD中小胶质细胞活化和细胞因子释放的机制，介绍了自噬的研究背景。
5.BECN1与自噬的关系及相关研究背景
6.本研究的目的：小胶质细胞BECN1在神经炎症调节中的中心作用
通过背景就可以了解到这篇文章的关键内容：
1.疾病：阿尔茨海默病（AD）
2.疾病相关细胞：小胶质细胞
3.研究水平：动物+细胞
4.机制研究：Beclin1介导的自噬；NLRP3炎症小体
研究方法：
这篇文章分别在体内和体外进行验证，细胞实验是从Beclin1敲除的小鼠中提取小胶质细胞，分别给予饥饿处理、Bafilomycin A1（自噬抑制剂）、3MA（自噬抑制剂）、LPS/ATP处理（诱导炎症），检测自噬和NLRP3炎症小体等促炎因子，检测LC3和NLRP3的共定位以证明自噬体与NLRP3炎症小体的关系，并检测了自噬衔接蛋白CALCOCO2/NDP52与NLRP3的关系。动物实验主要是在Beclin1敲除基础上制作了AD小鼠模型，检测了大脑组织红炎症因子IL-1β，IL-6的表达。本研究用到的实验方法包括：AD造模，小胶质细胞培养和处理，siRNA转染，ELISA,Western-blot，吞噬实验分析，免疫组化，立体测量，接头蛋白ASC检测，共聚焦显微镜观察。
我们来看研究结果：
1.自噬在Beclin1敲除的小鼠中受损
A：野生小鼠和Beclin1敲除小鼠提取的小胶质细胞，在饥饿培养基（HBSS）和正常培养基（Medium）中，经过Bafilomycin A1（Baf，自噬抑制剂）处理或不处理的细胞Beclin1的蛋白表达。
B：野生小鼠和Beclin1敲除小鼠提取的小胶质细胞，在饥饿培养基（HBSS）和正常培养基（Medium）中，经过Bafilomycin A1（Baf，自噬抑制剂）处理或不处理的细胞中自噬蛋白LC3的表达，提示Beclin1敲除的小鼠中LC3II表达是下调的，Baf能抑制LC3II的表达。
C：野生小鼠和Beclin1敲除小鼠提取的小胶质细胞，在饥饿培养基（HBSS）和正常培养基（Medium）中，经过Baf处理后LC3阳性细胞数量。
2. Beclin1的降低会导致IL-1β和IL-18释放的增加
A和B：从野生型或Beclin1敲除的小鼠中提取小胶质细胞，给予LPS/ATP处理，用ELISA检测了上清液中IL-1β和IL-18的表达，结果提示LPS/ATP炎性刺激会明显提高IL-1β和IL-18的表达。
C: 在饥饿培养基（HBSS）和正常培养基（Medium）中的小胶质细胞，分别给予LPS/ATP和3-MA（自噬抑制剂）处理，结果提示LPS/ATP会提高IL-1β的表达，3-MA会促进IL-1β的表达增高。
D:在饥饿培养基（HBSS）的小胶质细胞，分别给予或不给予3-MA处理，观察LC3表达阳性的细胞。
E: 在野生型或Beclin1敲除小鼠基础上构建AD模型（APPPSI），电化学发光法结果提示Beclin1敲除后构建的AD模型中IL-1β表达明显增高。
F: 电化学发光法检测了AD模型和Beclin1敲除的AD模型在不同溶液条件下(TBS,TX,SDS)的大脑组织中淀粉样蛋白（Amyloid-beta 1-40 和1-42）的表达。
3.Beclin1的减少影响了IL-1β的进展通路。
A和B：从野生型或Beclin1敲除的小鼠中提取小胶质细胞，给予LPS/ATP处理，Western-blot和PCR检测了NLRP3的表达，结果提示LPS/ATP炎性刺激会提高NLRP3的蛋白和mRNA表达。
C：从野生型或Beclin1敲除的小鼠中提取小胶质细胞，给予LPS/ATP处理，免疫荧光检测各组ASC的表达，结果提示Beclin1敲除的小胶质细胞中ASC表达提高，LPS/ATP能提高ASC的表达。
D: Western-blot检测了野生型或Beclin1敲除的小鼠小胶质细胞中Caspase1(CASP1（p10）)蛋白的表达,结果提示Beclin1敲除的小鼠小胶质细胞中CASP1表达增高。
4.NLRP3与LC3阳性囊泡密切相关。
A:从野生型或Beclin1敲除的小鼠中提取小胶质细胞，给予LPS/ATP处理，共聚焦显微镜下观察发现LPS/ATP提高了小鼠小胶质细胞中LC3和NLRP3的聚集，两者存在共定位现象。
B: 超分辨率显微镜(SIM)观察LPS/ATP处理的野生型小鼠小胶质细胞中NLRP3和LC3的表达和聚集情况。
C: 野生型小胶质细胞SIM图像中NLRP3和LC3信号的三维径向强度分布，以NLRP3簇的最大值为中心。径向分布证实了两种蛋白质与同一个细胞器共定位。
5. CALCOCO2/NDP52与NLRP3共定位并调控了IL-1β的释放。
A、B和C:方法和Figure4一样，就是检测了LPS/ATP处理的野生型小鼠小胶质细胞中NLRP3和CALCOCO2表达和共定位的情况。
D:SIM图像分析LC3和CALCOCO2的关系。
E和F: siRNA转染沉默Beclin1敲除小鼠小胶质细胞CALCOCO2的表达，结果提示CALCOCO2下调会提高IL-1β的表达。
结果总结：自噬可以通过降解NLRP3调节IL-1β和IL-18的产生来影响小胶质细胞的激活，从而提出了一种自噬受损如何导致阿尔茨海默病神经炎症的机制。
这篇文章数据量并不大，但是能发在11分的杂志，值得我们深思，对于新手来说主要有以下几个学习的点：
1.提出了一个新的AD发生机制，这个机制从神经炎症角度研究了小胶质细胞自噬和NLRP3炎症小体介导的焦亡途径两个热点。
2. 细胞焦亡涉及的关键蛋白主要包括：NLRP3炎症小体，ASC接头蛋白，Caspase1，IL-1β和IL-18炎症因子。
3. 用了Beclin1敲除的小鼠。
4. 阿尔茨海默病的造模方法：APPPSI模型
5. 细胞试验诱导炎症的方法：LPS/ATP。
6. 自噬的抑制，采用自噬抑制剂Baf和3-MA
这篇文章同样可以凝练成一个课题：Beclin1诱导自噬调控小胶质细胞焦亡在阿尔茨海默病中的机制研究
