文献解读:自噬、焦亡和阿尔茨海默病的结合

上次跟大家一起学习了1篇脑卒中跟自噬相关的研究,比较简单,算是自噬研究的入门了,今天我们继续来看文献,今天解读的是一篇阿尔茨海默病相关的,同样是自噬,但是这篇文章把自噬跟NLRP3炎性小体结合起来了,而NLRP3炎性小体是介导细胞焦亡的关键因此这篇文章也算结合了细胞自噬和焦亡2个热点。

这篇文章的题目是:Beclin1-drivenautophagy modulates the inflammatory response of microglia via NLRP3Beclin1驱动的自噬通过NLRP3调控小胶质细胞的炎症反应2019年发表在The EMBO Journal 杂志,当前影响因子是11.227

先来看研究背景:

主要交待了几个方面的内容:

1.阿尔茨海默病(AD)的简介;

2.小胶质细胞在AD发病中的作用;

3.炎症与AD的关系,引出IL-1β和NLRP3。

4.AD中小胶质细胞活化和细胞因子释放的机制,介绍了自噬的研究背景。

5.BECN1与自噬的关系及相关研究背景

6.本研究的目的:小胶质细胞BECN1在神经炎症调节中的中心作用

 

通过背景就可以了解到这篇文章的关键内容:

1.疾病:阿尔茨海默病(AD)

2.疾病相关细胞:小胶质细胞

3.研究水平:动物+细胞

4.机制研究:Beclin1介导的自噬;NLRP3炎症小体

研究方法:

这篇文章分别在体内和体外进行验证,细胞实验是从Beclin1敲除的小鼠中提取小胶质细胞,分别给予饥饿处理、Bafilomycin A1(自噬抑制剂)、3MA(自噬抑制剂)、LPS/ATP处理(诱导炎症),检测自噬和NLRP3炎症小体等促炎因子,检测LC3和NLRP3的共定位以证明自噬体与NLRP3炎症小体的关系,并检测了自噬衔接蛋白CALCOCO2/NDP52与NLRP3的关系。动物实验主要是在Beclin1敲除基础上制作了AD小鼠模型,检测了大脑组织红炎症因子IL-1β,IL-6的表达。本研究用到的实验方法包括:AD造模,小胶质细胞培养和处理,siRNA转染,ELISA,Western-blot,吞噬实验分析,免疫组化,立体测量,接头蛋白ASC检测,共聚焦显微镜观察。

 

我们来看研究结果:

1.自噬在Beclin1敲除的小鼠中受损

A:野生小鼠和Beclin1敲除小鼠提取的小胶质细胞,在饥饿培养基(HBSS)和正常培养基(Medium)中,经过Bafilomycin A1Baf,自噬抑制剂)处理或不处理的细胞Beclin1的蛋白表达。

B:野生小鼠和Beclin1敲除小鼠提取的小胶质细胞,在饥饿培养基(HBSS)和正常培养基(Medium)中,经过Bafilomycin A1Baf,自噬抑制剂)处理或不处理的细胞中自噬蛋白LC3的表达,提示Beclin1敲除的小鼠中LC3II表达是下调的,Baf能抑制LC3II的表达。

C:野生小鼠和Beclin1敲除小鼠提取的小胶质细胞,在饥饿培养基(HBSS)和正常培养基(Medium)中,经过Baf处理后LC3阳性细胞数量。

 

2. Beclin1的降低会导致IL-1β和IL-18释放的增加

A和B:从野生型或Beclin1敲除的小鼠中提取小胶质细胞,给予LPS/ATP处理,用ELISA检测了上清液中IL-1β和IL-18的表达,结果提示LPS/ATP炎性刺激会明显提高IL-1β和IL-18的表达。

C: 在饥饿培养基(HBSS)和正常培养基(Medium)中的小胶质细胞,分别给予LPS/ATP3-MA(自噬抑制剂)处理,结果提示LPS/ATP会提高IL-1β的表达,3-MA会促进IL-1β的表达增高。

D:在饥饿培养基(HBSS)的小胶质细胞,分别给予或不给予3-MA处理,观察LC3表达阳性的细胞。

E: 在野生型或Beclin1敲除小鼠基础上构建AD模型(APPPSI),电化学发光法结果提示Beclin1敲除后构建的AD模型中IL-1β表达明显增高。

F: 电化学发光法检测了AD模型和Beclin1敲除的AD模型在不同溶液条件下(TBS,TX,SDS)的大脑组织中淀粉样蛋白(Amyloid-beta 1-40 1-42)的表达。

 

3.Beclin1的减少影响了IL-1β的进展通路。

A和B:从野生型或Beclin1敲除的小鼠中提取小胶质细胞,给予LPS/ATP处理,Western-blot和PCR检测了NLRP3的表达,结果提示LPS/ATP炎性刺激会提高NLRP3的蛋白和mRNA表达。

C:从野生型或Beclin1敲除的小鼠中提取小胶质细胞,给予LPS/ATP处理,免疫荧光检测各组ASC的表达,结果提示Beclin1敲除的小胶质细胞中ASC表达提高,LPS/ATP能提高ASC的表达。

D: Western-blot检测了野生型或Beclin1敲除的小鼠小胶质细胞中Caspase1(CASP1p10)蛋白的表达,结果提示Beclin1敲除的小鼠小胶质细胞中CASP1表达增高。

 

4.NLRP3LC3阳性囊泡密切相关。

 

A:从野生型或Beclin1敲除的小鼠中提取小胶质细胞,给予LPS/ATP处理,共聚焦显微镜下观察发现LPS/ATP提高了小鼠小胶质细胞中LC3NLRP3的聚集,两者存在共定位现象。

B: 超分辨率显微镜(SIM)观察LPS/ATP处理的野生型小鼠小胶质细胞中NLRP3LC3的表达和聚集情况。

C: 野生型小胶质细胞SIM图像中NLRP3LC3信号的三维径向强度分布,以NLRP3簇的最大值为中心。径向分布证实了两种蛋白质与同一个细胞器共定位。

 

5. CALCOCO2/NDP52NLRP3共定位并调控了IL-1β的释放。

ABC:方法和Figure4一样,就是检测了LPS/ATP处理的野生型小鼠小胶质细胞中NLRP3CALCOCO2表达和共定位的情况。

D:SIM图像分析LC3CALCOCO2的关系。

EF: siRNA转染沉默Beclin1敲除小鼠小胶质细胞CALCOCO2的表达,结果提示CALCOCO2下调会提高IL-1β的表达。

 

结果总结:自噬可以通过降解NLRP3调节IL-1β和IL-18的产生来影响小胶质细胞的激活,从而提出了一种自噬受损如何导致阿尔茨海默病神经炎症的机制。

 

这篇文章数据量并不大,但是能发在11分的杂志,值得我们深思,对于新手来说主要有以下几个学习的点:

1.提出了一个新的AD发生机制,这个机制从神经炎症角度研究了小胶质细胞自噬和NLRP3炎症小体介导的焦亡途径两个热点。

2. 细胞焦亡涉及的关键蛋白主要包括:NLRP3炎症小体,ASC接头蛋白,Caspase1,IL-1β和IL-18炎症因子。

3. 用了Beclin1敲除的小鼠。

4. 阿尔茨海默病的造模方法:APPPSI模型

5. 细胞试验诱导炎症的方法:LPS/ATP。

6. 自噬的抑制,采用自噬抑制剂Baf和3-MA

 

这篇文章同样可以凝练成一个课题:Beclin1诱导自噬调控小胶质细胞焦亡在阿尔茨海默病中的机制研究

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