探索肿瘤恶病质发病的分子机制以及治疗方法

今天和大家分享的是今年3月份发表在Journal of Cachexia Sarcopenia and Muscle(IF:10.754)上的一篇文章,“Adipose depot gene expression and intelectin-1 in the metabolic response to cancer and cachexia”,作者希望通过对肿瘤恶病质,体重稳定的肿瘤患者以及对照组两个不同脂肪组织的基因表达谱的比较分析,探索肿瘤恶病质发病的分子机制以及治疗方法。让我们来深入解读一下这篇文章。

Adipose depot gene expression and intelectin-1 in the metabolic response to cancer and cachexia

贮脂基因表达和intelectin-1在癌症和恶病质代谢反应中的作用

一. 文章背景

恶病质(Cachexia)是一种与包括肿瘤在内的,多种慢性疾病相关的复杂的代谢综合征,以肌肉尤其是骨骼肌和脂肪组织的丢失为特征。患者骨骼肌的丢失一直是诊断的关键因素,近年来也有研究表明脂肪组织的丢失也在肿瘤恶病质中起重要作用,抑制贮脂细胞中脂解途径的发生可以抑制肿瘤恶病质(Cancer cachexia,CC)中肌肉的减少,而CC中调控脂解的因素还未知。在对在小鼠的CC研究过程中发现,内脏脂肪组织(Visceral Adipose Tissue,VAT)与皮下脂肪组织(Subcutaneous Adipose Tissue,SAT)相比丢失速度更快。这暗示在CC的过程中,脂肪细胞可能通过”fat-muscle crosstalk”导致了肌肉的丢失。然而此领域中对人的研究还尚少。作者希望通过对CC患者以及无恶病质的肿瘤患者(weight stable cancer,CWS)的VAT和SAT基因表达谱分析,探究引起CC的分子机制以及治疗方法。

 

二. 文章思路

三. 结果解析

1. 对样本分组,用基因芯片技术获取基因表达谱

实验的样本分为三组,分别为对照组,CC组以及CWS组,每组各8个样本。其中CC组(已鉴定)和CWS组的样本都为要进行切除手术的胃肠癌患者(包括食管癌,胃癌和胰腺癌)。对照组的样本为要进行肾切除手术的健康人。表1是各组样本的人体测量信息,可以看到CC患者有显著的体重丢失;与对照组相比,CC组和CWS组患者年龄显著偏大

表1. 各组样本的人体测量信息

 

取各组样本的SAT和VAT用Clariom S GeneChip 芯片检测基因表达量,所有样本的基因芯片数据按SCAN-UPC包的步骤进行过滤,共有8679(约站49%)的探针由于表达量过低或无被过滤。图1. A-B分别是在经过SCAN-UPC处理前后的样本PCA分析图,可以看到样本在处理前混在一起(A);经过滤后CC和CWS组的VAT(红,黄三角)与自己的SAT以及对照组区分开了,说明有差异的存在,要进行下游分析

图1. 经UPC处理前后的样本PAC分析图

 

2. 在组内和组间展开差异分析

作者用limma包对组内的VAT VS SAT,组间的VAT,组间的SAT进行差异分析,DEG(差异表达基因)的筛选标准是FDR<0.05。结果如表2,可以看到在各组内,VAT和SAT间基因表达差异都非常之大,其中CC组内的DEGs最多(n=2101);在各组间VAT的比较中,CC和CWS组间并没有显著的DEGs

表2. 各组内以及组间差异分析的结果

 

作者发现在VAT的组间比较中,ITLN1(Intelectin-1)是CC和CWS组与对照组比较当中表达量上调倍数最大的基因,分别是10倍和9倍(图2,红色)。而其在SAT的组间比较中差异并不显著。以上结果说明SAT对肿瘤或CC的敏感度不高,各基因表达量稳定;而VAT对肿瘤或CC敏感,很多基因表达量会受影响

图2. ITLN1在各组的VAT和SAT中的表达量

 

3. 基因富集分析

作者利用的MSigDB中的hallmark和curated基因集对组内VAT-SAT比较组和组间的VAT比较组进行GSEA分析,结果如表2所示(只展示了都显著富集的一些基因集)

作者首先分析了每组中不同脂肪组织之间的差异:

  • 在组内的VAT-SAT比较组中,脂肪生成和脂肪酸代谢基因集在CC和CWS组的SAT中显著富集,而相同基因集却在对照组的VAT中显著富集
  • 在组内的VAT-SAT比较组中,炎症反应基因集在CC和对照组的VAT中显著富集(图3),但是对富集得分贡献最大的基因不同(图3紫框中);CWS组中炎症反应基因的表达模式与CC相似,但是在VAT中的富集并不显著
  • 结论:不论肿瘤患者是否有恶病质,在VAT中脂肪组织生长相关的基因下调,同时炎症反应相关基因在VAT中表达上调

接下来作者分析了组间VAT的差异:

  • 在CC和CWS组的VAT与对照组VAT的比较中,脂肪形成和异物代谢相关基因集表达量显著降低
  • 在CC与对照组AVT的比较中,氧化磷酸化基因集在CC组VAT中表达量显著降低
  • 因为在肿瘤病人的VAT中,能量代谢相关基因表达下调,所以作者又针对棕色脂肪组织分化相关基因(GO:0045444),对组间比较的各组进行了GO分析,发现在CC和CWS组与对照组VAT的比较中,表达量下调的基因中富集棕色脂肪组织分化相关基因

表3. 组内和组间的GSEA分析结果

 

图3. 炎症反应基因集在各样本中的表达量热图

 

小结:在肿瘤患者的VAT中,与脂肪生成以及能量产生/利用相关的基因表达量下调,这种特征在CC患者中更明显

4. qRT-PCR验证候选分子

作者用qRT-PCR实验来检测包括微阵列候选分子(ALOX15,ITLN1,PPAR2A),脂肪褐变相关基(PPARGC1A,PRDM16,UCP1),炎症相关基因(ACVR2A1,IL18,IL8)以及脂肪生成相关基因(LEPR,PDCD4,STAT5A)在内的共12各基因的表达量。

图4. qRT-PCR实验结果

 

5. ELISA法检测VAT和血浆中ITLN1的表达量

作者用ELISA法检测了三组中所有样本VAT中ITLN1的含量(图5),发现只有CC组与对照组比,VAT中ITLN1表达量显著上升(p=0.014)

图5. ELISA法检测各组VAT中ITLN1含量

 

考虑到ITLN1在CC样本的VAT中高表达,作者想检测样本循环系统中的ITLN1含量是否上升。作者在原有各组样本的基础上,又在各组添加了12个样本,取样本血浆后进行ELISA实验检测ITLN1的含量(图6,右上角的图浓度单位经log10转换)。只有CC组和CWS组样本的比较中,ILTN1在样本血浆中的含量显著提高(p=0.02)

图6. ELISA法检测各组样本血浆中ITLN1的含量

今天的文献分享就到这里了,让我们快速回顾一下。作者为研究CC发生的分子机制,先是用基因芯片技术获取了CC,WCS以及对照组VAT和SAT的基因表达谱,用SCAN-UPC包过滤低质量探针。用limma包进行了组内VAT-SAT以及组间VAT,SAT的差异分析,得到了ITLN1等候选分子;随后针对各组进行了GSEA分析。之后用qRT-PCR实验检测芯片候选分子,炎症分子,脂肪褐变以及脂肪生成共12个基因在样本VAT中的表达量;ELISA实验检测了ITLN1在各样本VAT以及血浆中的含量。本文亮点是有自己CC以及CWS队列的芯片数据,数据在GSE131835中,由于文章3月末发表,数据要到5月末才开放。

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