蛋白磷酸酶2A（PP2A）是由支架亚单位A、调节亚单位B和催化亚单位C这三类亚单位不同组合而成的一组磷酸酶，共包含多达60种全酶。不同的细胞和组织中产生多种功能不同、底物特异的PP2A复合物。亚单位A、C在真核生物中具有序列保守型，但是哺乳动物细胞表达15种不同的调节性亚单位B，在控制不同全酶的定位和活性方面起关键作用。之前的研究表明，Perphenazine化合物可作为PP2A的变构活化剂【1】，SMAPs等化合物可用于条件性活化PP2A【2】。这两类化合物都与PP2A的支架亚单位A之一——PPP2R1A互作，但这些药物如何精确地将亚单位B和C招募到变构的活性酶复合物，目前仍不清楚。
PP2A磷酸酶是肿瘤抑制因子，但其亚单位基因在肿瘤细胞中通常以未突变蛋白的形式表达。PP2A亚单位的失活突变频率较低，PPP2R1A亚单位的突变率最高，9759例类型不同的人类癌症诊断样本的突变率为1.17%【3】。因此，癌细胞并不依赖PP2A亚单位基因本身的突变失活，而是通过过度表达辅助蛋白，促进其介导翻译后修饰或其他方式阻断PP2A酶活性，来逃避PP2A介导的肿瘤抑制。PP2A亚单位是以完整蛋白的形式在癌症细胞中表达，故变构小分子可以结合并诱导构象变化，从而诱导PP2A磷酸酶从抑制状态转变为活化状态。Perphenazine（PPZ）及相关的杂环化合物可结合和抑制大脑皮层多巴胺及其相关受体信号，可用作治疗精神疾病，而研究显示这些化合物可激活PP2A。但由于这些化合物抑制基底节多巴胺受体DRD2，导致剂量限制性锥体外系运动障碍，而具有严重的副作用，限制其在临床上的使用。所以，如何提高PPZ的PP2A变构激活剂活性的同时，又减少其副作用，这是亟需解决的问题。
2020年4月20日，来自哈佛医学院的A. Thomas Look在Cell杂志上发表文章Allosteric Activators of Protein Phosphatase 2A Display Broad Antitumor Activity Mediated by Dephosphorylation of MYBL2，鉴定出一系列小分子iHAPs（改善型PP2A杂环活化剂）能够变构性激活由支架亚单位PPP2R1A、调控亚单位PPP2R5E（B56ε）和催化亚单位PPP2CA组成的特异性PP2A全酶，从而杀伤白血病细胞。其中化合物iHAP1能够激活该特异性PP2A全酶，同时对多巴胺受体DRD2没有抑制作用，避免诱导神经毒性。iHAP1激活的PP2A全酶可使转录因子MYBL2的Ser241位去磷酸化，导致白血病和其他癌细胞不可逆转地停滞在细胞周期的前中期。此外，化合物SMAPs激活含有不同调节亚单位的PP2A全酶，不能导致MYBL2的去磷酸化，但导致肿瘤细胞停滞在G1期，显示出不同的作用机制。
为了鉴定能够激活PP2A但又不抑制DRD2的PPZ同源物，研究人员就90种不同的化合物对KOPT-K1细胞生长的抑制、PP2A磷酸酶活性的激活能力、对DRD2多巴胺信号的抑制进行检测。其中iHAP1是最有潜能的PPZ同源物，其激活PP2A磷酸酶活性的能力是PPZ的10倍，对T-ALL细胞系和白血病人来源的T-ALL细胞生长都具有显著的抑制活性，同时对DRD2没有抑制作用。T-ALL斑马鱼模型和小鼠模型都显示，iHAP1的体内抗肿瘤活性远高于PPZ，且神经毒性降低。组化和流式细胞术检测显示，iHAP1处理导致小鼠的股骨、肝脏和脾脏中hCD45+白血病细胞显著降低。PPZ/iHAP1处理导致KOPT-K1细胞停滞在G2/M期，即细胞周期前中期的早期，当细胞具有单级纺锤体时，同时编码建立纺锤体双极性所需蛋白质的基因被下调。即PPZ/iHAP1靶向激活的PP2A复合物阻断了前中期纺锤体单极性阶段中细胞周期所需蛋白质表达上调的转录途径。
那么iHAP1激活的PP2A所催化去磷酸化反应的关键底物是什么？利用同位素标记质谱法检测发现，转录因子MYBL2是最有可能的底物，且位于转录激活结构域的Ser241是去磷酸化的位点。利用shRNA敲低MYBL2基因导致细胞周期停滞在纺锤体单极性的早中期，且下调细胞周期前进所需蛋白的表达，与iHAP1/PPZ处理导致的表型类似。回补试验证明，MYBL2的反式激活功能特异性依赖于Ser241的磷酸化，对肿瘤细胞成功通过细胞周期前中期是必需的。此外，表达S241D磷酸化突变导致细胞对iHAP1处理产生抵抗性，即PP2A介导的MYBL2 Ser241位去磷酸化是iHAP1对T-ALL行使抗肿瘤活性的充要条件。PPZ/iHAP1处理6h导致MYBL2蛋白水平下降，蛋白的半衰期变短，加速MYBL2蛋白的降解。同时，iHAP1对T-ALL细胞生长的抑制和杀伤机制同样适用于其他类型的白血病和实体瘤。
为了进一步探索iHAP1激活的PP2A全酶的亚单位组成，研究人员利用CRISPR-Cas9分别敲除19种特异性PP2A亚单位的细胞系，发现只有缺失了PPP2R1A、PPP2CA或PPP2R5E（B56ε）亚单位的细胞对iHAP1/PPZ处理具有抵抗性。而小分子SMAPs被证明能够条件性激活PP2A，其激活的PP2A全酶组成是PPP2R1A、PPP2CA或PPP2R2A（B55α）。免疫共沉淀试验显示，DMSO处理细胞中PP2A全酶组成为PPP2R1A、STRN（调节性亚单位B）和PPP2R5A（B56α），iHAP1刺激导致STRN被PPP2R5E（B56ε）所替代，而SMAP刺激则导致STRN被PPP2R2A（B55α）所替代，显示出两者激活全酶的亚单位组成不同。SMAP处理不能导致MYBL2 Ser241位磷酸化修饰改变，且细胞周期停滞在G0/G1期，在前中期没有停滞现象。
亮氨酸羟基甲基转移酶1（LCMT1）导致PP2A催化亚单位的Lys309位甲基化，激活PP2A活性，而蛋白磷酸酶甲基酯酶1（PPME1）能够导致Lys309去甲基化，抑制PP2A亚单位的聚集和活性。实际上，原代T-ALL细胞及T-ALL细胞系中PPME1表达显著上调。利用shRNA敲低PPME1表达导致PPP2CA催化亚基的Lys309甲基化上升，且明显抑制细胞生长，细胞周期停滞在纺锤体单极性的前中期，表型与iHAP1/PPZ处理类似。体外纯化试验显示，异源三聚体PP2A全酶仅在LCMT1催化PPP2CA Lys309甲基化时自发形成，而未甲基化的PPP2CA与PPP2R1A形成异二聚体。此外，iHAP1能超越PPME1蛋白的抑制作用，驱动未甲基化PPP2CA、PPP2R1A和PPP2R5E（B56ε）形成PP2A复合物。
总的来说，研究鉴定出一个非常有潜力的PP2A变构激活剂iHAP1，并揭示出iHAP促进PPP2R1A、PPP2R5E（B56ε）和PPP2CA组成的PP2A全酶的聚集和活性，靶向转录因子MYBL2 Ser241位去磷酸化，从而导致白血病和实体瘤细胞不可逆转地停滞在细胞周期前中期，进而实现抗肿瘤活性。iHAP不仅能够强力地激活PP2A，而且神经毒性低，或将能够用于PP2A靶向的抗肿瘤治疗。
1. Gutierrez, A., Pan, L., Groen, R.W., Baleydier, F., Kentsis, A., Marineau, J., Grebliunaite, R., Kozakewich, E., Reed, C., Pflumio, F., et al. (2014). Phenothi- azines induce PP2A-mediated apoptosis in T cell acute lymphoblastic leuke- mia. J. Clin. Invest. 124, 644–655.
2. Sangodkar, J., Perl, A., Tohme, R., Kiselar, J., Kastrinsky, D.B., Zaware, N., Izadmehr, S., Mazhar, S., Wiredja, D.D., O’Connor, C.M., et al. (2017). Activa- tion of tumor suppressor protein PP2A inhibits KRAS-driven tumor growth. J. Clin. Invest. 127, 2081–2090.
3. Sangodkar, J., Farrington, C.C., McClinch, K., Galsky, M.D., Kastrinsky, D.B., and Narla, G. (2016). All roads lead to PP2A: exploiting the therapeutic poten- tial of this phosphatase. FEBS J. 283, 1004–1024.
