基于网络药理学的疏风解毒胶囊治疗新型冠状病毒肺炎的分子机制探析

摘  要:目的  探讨疏风解毒胶囊治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的分子机制。方法  借助中药系统药理学分析平台(TCMSP)检索疏风解毒胶囊有效活性成分及作用靶点。运用GeneGards等数据库对疾病靶点进行筛选,使用Cytoscape 3.7.2软件构建活性成分-靶点网络和蛋白互作(PPI)网络,通过DAVID数据库对靶点进行GO功能分析和KEGG通路富集分析。结果 共得到疏风解毒胶囊有效活性成分共207个,其中作用于COVID-19的60个活性成分可通过46个潜在靶标作用于COVID-19。富集得到GO中1 343个生物过程条目和6条KEGG通路,涉及内分泌抵抗、MAPK信号通路、精氨酸生物合成路径等。结论 疏风解毒胶囊主要通过黄酮类和植物甾醇类活性成分调节IL6、IL1B、CCL2、MAPK8、MAPK1、MAPK14、CASP3、FOS、ALB等关键靶点,调控炎症反应、氧化应激损伤、细胞凋亡、肺纤维化增生等过程减轻肺损伤来治疗COVID-19。

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19),具有强烈的传染性和人群普遍易感性[1],目前临床尚无治疗COVID-19的特效药物,如何形成快速有效的COVID-19治疗方案,是当前面临的重大问题。祖国医学在重大疫情的防治上一直发挥着重要作用,中医药辨证论治在此次疫情中疗效肯定,具有其独特的优势,被广泛运用。疏风解毒胶囊在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行)》第四~七版多个COVID-19诊疗方案中均被推荐用于COVID-19的治疗[2-3]

风解毒胶囊由虎杖、连翘、板蓝根、柴胡、败酱草、马鞭草、芦根、甘草8味中药组成,有广谱的抗病毒功效,且对多种细菌亦有一定的抑制作用,同时具有抗炎作用和显著的免疫调节作用[4-7],临床广泛应用于上下呼吸道感染、急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)等疾病的治疗[8-11],针对COVID-19,疏风解毒胶囊临床联合用药也有显著疗效[2]。但疏风解毒胶囊治疗COVID-19的机制尚不明确。随着网络药理学的完善与发展,中医药发挥临床疗效的分子及机制研究也逐渐变得可视化、效率化和标准化。网络药理学融合了系统生物学、网络生物学、计算生物学、多向药理学、分子药理学、分子动力学等多学科技术和内容,构建和整合“疾病表型基因药物”多层次网络,为中药复方多靶点、多成分、整体性、系统性作用机制研究提供强有力的技术支撑[12],可用于预测推断小分子与基因、蛋白质、代谢物等靶标和网络的相关性。其理论的建立为多靶点药物的研究提供科学理论支持,也为研发新药提供理论源泉。本研究使用网络药理学的方法研究疏风解毒胶囊对COVID-19的潜在治疗机制,对于将疏风解毒胶囊更广泛地应用于抗COVID-19以及其他疾病均将起到理论上的支持作用。

1  方法

1.1  疏风解毒胶囊活性成分的筛选及潜在作用靶点的预测

本研究利用TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)对疏风解毒胶囊中8味中药相关的活性成分进行搜索,以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18为筛选标准,将得到符合条件的候选活性成分靶点信息通过Uniport数据库使基因名标准化。

1.2  COVID-19靶点的预测

登录GeneCards数据库(https://www.genecards. org/)和OMIM数据库(https://omim.org/)以“coronavirus disease 2019”“novel coronavirus pneumonia”“novel coronavirus 2019”为关键词检索与COVID-19的相关基因,收集得到疾病相关靶基因。

1.3  中药活性成分靶点网络构建

将中药活性成分相关靶点与疾病相关靶点取交集,利用Cytoscape 3.7软件构建中药活性成分靶点网络图。

1.4  蛋白互作PPI网络的构建和核心靶点的筛选

将“1.3”项中得到的交集靶点信息导入String数据库,选择物种为“Homo sapiens”,置信度>0.4为筛选条件下载得到交集靶点的PPI信息,利用Cytoscape软件做图将其可视化。

1.5  靶点基因生物信息富集分析

将疏风解毒胶囊作用于COVID-19的所有靶点导入DAVID数据库(https://DAVID.ncifcrf.gov),限定物种为人,进行基因本体论(gene ontologyGO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomesKEGG)通路富集分析,筛选P0.05的生物过程及信号通路,用R包(ggplot2)绘图将其可视化。

1.6  基因通路网络构建

利用“1.5”项筛选得到的信号通路和信号通路中富集得到的基因信息,使用Cytoscape软件构建基因信号通路网络图,将其可视化。

2  结果

2.1  疏风解毒胶囊活性成分及作用靶点信息收集

通过TCMSP平台检索到符合标准的疏风解毒胶囊活性成分共207个,其中败酱草13个,板蓝根39个,柴胡17个,甘草92个,虎杖10个,连翘23个,芦根1个,马鞭草12个。将所获得的活性成分预测靶点导入Uniprot数据库进行基因标准化,去除重复值,共得到作用靶点基因226个。

2.2  新型冠状病毒肺炎靶点的收集

使用GenCardsOMIM数据库共收集到COVID-19潜在靶点259个、4个,合并后共收集到263COVID-19相关靶点。

2.3  中药活性成分靶点网络分析

利用Excel表格将“2.1”项中筛选得到的疏风解毒胶囊所有作用靶点226个和“2.2”项中疾病所有相关靶点263个进行重复对比,最终得到46个交集靶点,说明疏风解毒胶囊可通过46个靶点作用于COVID-1946个作用靶点对应60种中药活性成分,60种中药活性成分信息及对应靶点数目见表1。运用Cytoscape软件构建中药活性成分靶点网络(图1),网络中共有113个节点和324条边,113个节点中包含7种中药名(其中复合中药名表现该节点由至少2种中药复合而展现,多种中药里含有相同的活性成分,复合中药名中具体中药见表1),60种活性成分,46个作用靶点,每条边表示化合物和靶点之间的相互作用关系。其中槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、汉黄芩素(wogonin)、山柰酚(kaempferol)、刺槐素(acacetin)、异鼠李素(isorhamnetin)、5,7,4′-三羟基-8-甲氧基黄酮(5,7,4′- trihydroxy-8-methoxyflavone)、β-谷甾醇(β- sitosterol)这8种活性成分对应的靶点数目从高到低依次为3618141410877,且这8种成分可作用于46种交集基因中的43种,可认为是疏风解毒胶囊中的关键活性成分。

 

 

2.4  PPI网络分析

PPI核心网络(图2)包含46个节点,526条边。节点表示蛋白,每条边则表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系。图中由内到外颜色越浅代表该蛋白相互作用程度(度值,degree)越低。筛选出前5个节点度值的靶点蛋白,分别是IL6(度值为40)、CASP3(度值为37)、MAPK8(度值为37)、ALB(度值为36)、MAPK1(度值为36),表明这5个核心靶点在网络图中起关键作用。

2.5  GO功能富集与KEGG通路富集分析

将得到的46个作用靶点通过DAVID[13]数据库进行GOKEGG富集分析,共有1 451条生物功能显著富集(P0.05),1 343个在生物过程(BP)中富集,24个在细胞成分(CC)中富集,84个在分子功能(MF)中富集。选择排名前20GOBP条目绘制柱状图(图3),主要涉及脂多糖应答、对细菌来源分子反应、细胞凋亡和氧化应激等生物过程。一共6KEGG通路显著富集,包括内分泌治疗抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗、铂类耐药、抗叶酸等药物抵抗路径,精氨酸生物合成路径和MAPK信号通路(图4)。

2.6  基因通路网络分析

6KEGG通路信息和富集基因导入Cytocape软件构建基因通路网络(图5)。网络包含21个核心目标基因和6条通路。图形面积越大代表目标基因或通路在网络中发挥的作用越大。

3  讨论

《瘟疫论》曰:“今感疫气者,乃天地之毒气也”,COVID-19为中医学疫病范畴,病机核心在于湿毒疫邪侵袭,“毒”为COVID-19病理过程的核心致病因素和病理产物,尤以湿(疫)毒、热毒突出[14-15]。《吴医汇讲》曰“治疫之法,总以毒字为提纲”,强调了解毒在疫病中的重要作用,此次感染SARS-CoV-2患者以非危重型为主,疏风解毒胶囊用药轻、少,组方以虎杖为君,解毒为核心治法,虎杖可祛湿毒、解热毒、祛瘀毒,合以败酱草、马鞭草、芦根、连翘、板蓝根加强清解湿热疫毒之功,柴胡透邪退热,甘草解毒和中顾护正气,全方合用,以解毒为核心可清热、疏风、利咽、化瘀同时顾护正气,正切COVID-19病机,主要针对轻型、普通型症患者,适用人群广泛,已有研究表明用于治疗COVID-19具有良好疗效[4]。本研究借以疏风解毒胶囊的化学成分、靶点及通路信息等多项数据,构建网络对其功能分析,系统预测其对COVID-19多成分、多靶标的可能分子机制。

本研究得到了60个活性成分,筛选得到前8个关键活性成分分别为槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、山柰酚、刺槐素、异鼠李素、5,7,4′-三羟基-8-甲氧基黄酮、β-谷甾醇。除β-谷甾醇属于植物甾醇类,其余7种均属黄酮类。这与现有中药对COVID-19的活性成分研究结果相一致[16-18]。研究证明大多数黄酮类活性化合物有良好的抗病毒作用,可以通过阻断病毒和宿主受体结合、抑制病毒复制、直接靶向杀灭病毒、抑制机体炎症反应、调节宿主免疫反应等方面发挥广谱抗病毒活性[19]。研究证明黄酮库中64种活性成分在与SARS-CoV3CLpro进行荧光共振能量转移法(FRET)蛋白酶测定与分子对接实验后均可不同程度有效阻断SARS-CoV3CLpro酶活性而发挥抗病毒作用[20],也有学者同时使用模拟分子对接、表面等离子体共振(SPR)生物传感器技术和FRET生物测定法佐证了槲皮素-3β-半乳糖苷对SARS-CoV 3CLPro的明显抑制效应和治疗潜力[21]β-谷甾醇于广泛存在于各种植物油和果蔬中[22],在多数中药中含量也较为丰富,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调血脂、免疫调节等活性[23-24],研究证明β-谷甾醇具有类似激素的抗炎效应[25],可明显减轻脂多糖(LPS)可引起典型肺水肿、过度炎症反应等急性肺损伤病理变化,其保护机制可能与阻止炎症因子(TNF-αIL-6)释放和下调NF-κB信号转导通路的活化有关[26],最新COVID-19逝者尸体解剖病理也显示患者肺部渗出性反应明显,肺泡水肿,存在快速进展的过度炎症反应[27],这与β-谷甾醇抗肺损伤机制高度相符。

通过PPI网络分析筛选和基因通路网络分析可知疏风解毒胶囊主要通过IL6IL1BCCL2MAPK8MAPK1MAPK14CASP3FOSALB9个靶点发挥主要治疗作用。根据其作用属性和调控类型可以将其分为4大类:IL6IL1BCCL2均属于趋化因子,介导炎症反应;MAPK8MAPK1MAPK14归属于有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinaseMAPKs)家族成员,广泛参与细胞的增殖、分化、转化及凋亡过程;FOSCASP3主要调控细胞的增殖和凋亡;ALB表达控制白蛋白合成。大量研究证明炎症因子在肺炎的免疫及病理过程中起重要作用[28-29]。体外细胞实验[30]证实中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)这2种病毒在肺部的感染中不是通过显著刺激抗病毒细胞因子如干扰素表达,而是诱导IL6的大量释放从而引起严重的炎症和肺组织损伤;白细胞介素– 1βIL-1β)为关键促炎介质之一,可诱导受体IL-1RI上调,促进肺泡巨噬细胞(AM)焦磷酸化而增强肺部炎症[31]CCL2被认为是在SARS-CoV感染的肺上皮细胞中最早显著上调的趋化因子之一[32],其血清水平与严重急性呼吸综合征(SARS)感染的严重程度呈正相关[33]。王福生院士对全球首例COVID-19病理结果分析示其肺部病理特征与SARS和中东呼吸综合征(MERS)患者的病理征象十分相似[34],提示此3种趋化因子在COVID-19肺部炎症反应中发挥重要作用。MAPKs的激活广泛参与了肺损伤的发病和病理改变过程[35],主要通过激活下游MAPK/ERK信号通路、p38MAPK信号通路、JNK通路这3条路径诱导缺氧和缺血环境下的肺上皮细胞凋亡[36],激活AP-1促使人肺纤维化[37],增强肺组织氧化应激与过度炎症反应[38]。半胱氨酸蛋白酶-3CASP3)是凋亡下游的执行蛋白酶,Ning[39]通过体内小鼠实验研究证明CASP3可以显著抑制先天免疫激活,抑制其表达后可维持宿主在病毒感染状态下免疫稳态,防止细胞因子过度产生。C-FOSFOS基因产物,常与c-jun组成激活子蛋白-1AP-1)来调控细胞增殖、分化、转化及凋亡等过程[40]。研究发现在SARS-CoV感染中其辅助蛋白3b可能通过上调AP-1依赖性细胞因子水平而发挥致病作用[41]AP-1还可参与多种肺部炎症反应,促进杯状细胞的化生和黏液分泌,也能增加下游的基因表达而引发肺纤维化[42-43]。来自71份组群研究表明,血浆白蛋白水平对于患者的疾病的发生程度和预后具有重要作用,适当提高白蛋白水平能作为载体可逆性的结合阴阳离子、活性物质、有毒物质等,起到解毒、清除自由基的作用[44]

GO富集分析结果主要涉及脂多糖应答、对细菌来源分子反应、细胞凋亡和氧化应激等生物过程。细菌脂多糖在体外实验中能够直接诱导NO和活性氧的大量产生,介导肺部微血管细胞氧化应激损伤而加速急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发生发展[45]这与COVID-19重症患者出现的ARDS、感染性休克表现相一致[46]。病毒感染能引起细胞凋亡或程序性死亡,这既是机体对未感染细胞的一种保护性机制即及时清除部分被感染的有害细胞,亦可迅速导致宿主组织细胞损伤[47]。氧化应激反应不仅可直接损伤局部组织细胞,也可进一步激活多种信号通路诱导炎症反应,加速COVID-19患者的多器官损伤进程[48]

KEGG富集得到6条通路,包括内分泌治疗抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗、铂类耐药、抗叶酸等药物抵抗路径,精氨酸生物合成路径和MAPK信号通路。其中内分泌治疗抵抗路径与主要通过下游EGFR/HER1信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路和MAPK信号通路发挥作用[49],与细胞凋亡、炎性细胞募集、细胞恶性转化等过程相关[50-51]EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗、铂类耐药、抗叶酸等药物抵抗路径均与肺癌的治疗相关,可调节细胞因子和T细胞受体信号转导过程,参与调解细胞自噬和炎症反应[52-53],这与COVID-19的肺损伤机制密切相关。精氨酸合成代谢具有平衡免疫反应的作用,可降低损伤部位的炎症反应,减少炎症相关因子过度分泌对机体的损害[54]MAPK信号通路也是炎症反应中的重要通路。由此可以预测疏风解毒胶囊主要是通过减少炎症反应、调节机体免疫、抑制细胞损伤凋亡来达到治疗COVID-19的目的。

通过网络药理学技术初步阐明了疏风解毒胶囊通过多成分、多靶点、多通路治疗COVID-19的分子机制。研究结果与现报道的有关中药对COVID-19的干预研究既有重合靶点也有创新发现,但总体作用机制仍与炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、纤维增生等过程密切相关。鉴于网络药理学技术的局限性,后续需要更多针对性的实验研究予以佐证。

参考文献(略)

来  源:许嘉慧,薛  艳,张  炜,陆  灏. 基于网络药理学的疏风解毒胶囊治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的分子机制探析 [J]. 中草药, 2020, 51(8):2015-2023.

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