文献解读:lncRNA干湿结合5分文章研究思路

那么今天跟大家分享的是2020年2月发表在Aging(IF:5.515)杂志上的一篇文章The lncRNA ENSG00000254041.1 promotes cell invasiveness and associates with poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma.在文章中作者通过重新分析癌症基因组图谱TCGA-PAAD(胰腺癌)数据库,发现了一个与转移相关的lncRNA。然后,验证了ENSG00000254041.1的表达情况和预后意义。而后功能检测显示,ENSG00000254041.1增强了PC细胞的增殖、迁移、侵袭和耐药能力。

The lncRNA ENSG00000254041.1 promotes cell invasiveness and associates with poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma
lncRNA ENSG00000254041.1促进细胞侵袭性与胰腺导管腺癌预后不良有关

一.研究背景

大多数的胰腺癌(PC)患者是由于局部侵袭或广泛转移的导致的疾病。然而,肿瘤的侵袭和转移机制尚不明确。因此,在这一领域还需要进行一系列的研究,并提供潜在的标记物。

二.分析流程

三.结果解读

1.ENSG00000254041.1的表达与上皮细胞向间质转化的升高有关

作者利用ssGSEA基因特征评分评估TCGA-PAAD患者的转移特征评分(图1A)。然后作者进行了差异表达分析,筛选出了ENSG00000254041.1(图1B,表S1)。

为了验证ENSG00000254041.1的预后价值,作者接下来检测了24对肿瘤和对应癌旁组织样本中ENSG00000254041.1的差异表达。结果显示,与癌旁组织相比,ENSG00000254041.1的表达明显增加(图1C)。进一步分析发现,ENSG00000254041.1与包括SNAI1、SNAI2、VIM和ZEB1在内的EMT相关的基因转录本呈正相关(图1D)。

图1.ENSG00000254041.1在胰腺癌及邻近正常组织中的表达
 

表S1.高、低EMT特征评分的样本间差异表达基因(部分)

2.ENSG00000254041.1预后分析

作者采用RT-PCR检测70例肿瘤组织标本中ENSG00000254141.1的表达水平,根据ENSG00000254041.1的表达水平(以中位值作为截断值)将其分为两组。生存分析显示,低表达组具有更好的OS(图1A)。

单变量Cox回归分析,发现ENSG00000254041.1的表达和临床分期是预测预后的指标。多变量分析显示,ENSG00000254041.1的表达和肿瘤晚期(III/IV)仍然是临床结果的独立预测因素(图2B)。然后通过ROC曲线来评估ENSG00000254041.1表达和AJCC分期的生存预测的敏感性和特异性,结果发现将两者结合后所得的AUC更高(图2C)。

图2.ENSG00000254041.1是胰腺癌的预后标志物

3.ENSG00000254041.1对细胞周期和细胞增殖的影响

作者将siRNA转染进ENSG00000254041.1表达水平较高的2个PC细胞系(SW1990和BxPC-3),而将过表达载体转染进ENSG00000254041.1表达水平较低Panc-1细胞系(图S1)。

  • 在SW1990和BxPC-3细胞系中,ENSG00000254041.1表达下调时S期的百分比下降,G0/G1期的百分比升高,而在Panc-1细胞系中,ENSG00000254041.1过表达时S期的百分比升高,G0/G1期的百分比下降(图3A)。

  • 细胞增殖实验也表明,下调ENSG00000254041.1抑制了SW1990和BxPC-3细胞系的增殖,而过表达ENSG00000254041.1促进Panc-1细胞的增殖(图3B)。

图3.ENSG00000254041.1对PC细胞的细胞周期和细胞增殖的影响

图S1.三个细胞系的ENSG00000254041.1的表达情况
 

4.ENSG00000254041.1通过调控SOX4的表达来驱动上皮-间质转化(EMT)

接着研究ENSG00000254041.1相关的通路,作者将GSE15471数据集作GSEA,EMT通路显著富集(图4A,图S2)。

  • 作者然后作transwell实验来确定ENSG00000254041.1是否会影响PC的转移能力。在SW1990和BxPC-3细胞系中,ENSG00000254041.1表达的降低明显抑制了细胞的侵袭能力,而过表达ENSG00000254041.1则促进了Panc-1细胞的侵袭(图4B)。

  • western blot结果显示,SW1990和BxPC-3细胞系中ENSG00000254041.1的表达下调,导致间质标志物(vimentin和Snail)显著下调,上皮标志物(E-cadherin)显著上调;而Panc-1细胞中的ENSG00000254041.1过表达,导致vimentin和Snail的上调,而E-cadherin的下调(图4C)。

这些结果都在表明,在PC中ENSG00000254041.1可能能驱动上皮-间质转化。

图4.ENSG00000254041.1驱动上皮-间质转化(EMT)

  • 对ENSG00000254041.1RNA的表达与转移通路中mRNA作Pearson相关性分析,结果显示了该通路中SOX4的强相关性 (图5A)。

  • 作者使用RT-PCR检测SOX4在10例肿瘤组织和10例正常组织中的表达。结果显示PC样本肿瘤组织中SOX4水平的显著升高(图5B)。

  • 作者接着探讨ENSG00000254041.1是不是调控SOX4的表达来驱动EMT。结果显示:下调ENSG00000254041.1可以抑制SW1990和BxPC-3细胞系中SOX4的表达,而ENSG00000254041.1过表达可以增加Panc-1细胞系中SOX4的表达(图5C)。

 

图5.通过ENSG00000254041.1调控SOX4的表达

图S2.LncRNA ENSG00000254041与EMT通路的共表达分析

5.ENSG00000254041.1增强PC细胞对GEM的耐药

接下来作者进行了GSEA,以研究ENSG00000254041.1表达是否有助于PC患者的耐药。结果显示,在PC患者中,ENSG00000254041.1表达与多种耐药途径相关(图6A)。

作细胞生存分析,结果显示,敲除ENSG00000254041.1的SW1990和BxPC-3细胞系中GEM的IC50值降低,细胞存活状态差;而过表达ENSG00000254041.1的Panc-1细胞系中GEM的IC50值升高,细胞存活状态改善。说明ENSG00000254041.1可能增强PC细胞对GEM的耐药(图6B)。

图6.ENSG00000254041.1增强PC细胞对GEM的耐药

最后小结一下:在文章中作者通过重新分析癌症基因组图谱TCGA-PAAD(胰腺癌)数据库,发现了一个与转移相关的lncRNA。然后对ENSG00000254041.1的表达和预后意义作了评估和验证。而后利用SW1990、BxPC-3以及Panc-1三个细胞系验证了ENSG00000254041.1对PC细胞的促进增殖、迁移、侵袭和耐药能力。并发现了SOX4为潜在的调控机制。这项研究为PC的预后提供一个潜在的biomarker。

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