文献解读:m6A RNA甲基化4分文章思路

大家好,今天给大家分享一篇2020年3月发表在Front Oncol杂志上的文章,影响因子4.137。很新的一篇文章,文章的主要目的是研究m6A RNA甲基化调节因子在胶质母细胞瘤GBM中的表达、潜在功能和预后价值。

标题:Malignant Evaluation and Clinical Prognostic Values of m6A RNA Methylation Regulators in Glioblastoma.
m6A RNA甲基化调节因子在胶质母细胞瘤GBM中的潜在功能和预后价值
术语

m6A-RNA methylation:m6A-RNA甲基化,是一种最常见的mRNA修饰形式,与恶性肿瘤进展有关。

GBM:胶质母细胞瘤,是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤。

GSEA:基因集合富集分析。

PCA:主成分分析。

PPI:蛋白质-蛋白质互作网络。
一. 研究思路

从TCGA和CGGA数据库获取GBM的RNA-seq数据,从GTEx数据库获取正常组织的RNA-seq数据,并进行归一化处理。从已发表的文献中检索13个被广泛认可的m6A RNA甲基化调节因子。使用R包ConsensusClusterPlus将GBM患者分为两组,进行PCA和差异分析,对得到的差异基因进行GO和KEGG分析。利用STRING数据库与cytoscape软件构建与预后显著相关的DEGs和m6A RNA甲基化调节因子的PPI网络,从中筛选出重要模块。对13个m6A RNA甲基化调节因子的表达进行单因素Cox回归分析,以确定与总生存率(OS)相关的候选基因。之后,进行LASSO以进一步确定具有独立预后价值的候选基因。

二. 结果
1. m6A-RNA甲基化调控因子在GBM中的表达模式

对m6A-RNA甲基化调节因子在GBM疾病与正常样本的表达水平绘制热图结果表明,大多数m6A RNA甲基化调节因子的表达与GBM的发生有关(图1A)。CGGA的定量分析证实了GBM的发生与ALKBH5、METTL3、KIAA1429、HNRNPC、WATP、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和FTO的表达水平之间具有显著相关性(图1B)。

与正常组织样本相比,GBM样本中METTL3、HNRNPC、WTAP、KIAA1429、YTHDF2和YTHDF1的表达上调,而ALKBH5、YTHDC2和FTO的表达下调(图1C、D)。同时采用相关分析探讨m6A-RNA甲基化调节因子的表达水平与GBM不同分期(原发期和复发期)的关系。在13个m6A RNA甲基化调节因子中,只有HNRNPC与癌症复发显著相关(图1E)。

通过CGGA数据库分析原发性和复发性GBM样本的表达谱,发现HNRNPC之间没有相关性。而WTAP、ALKBH5和METTL14的表达与GBM的复发显著相关(图1F)。这些结果表明WTAP、ALKBH5和METTL14与GBM的复发过程密切相关(图1G,H)。

因此文章推测m6A-RNA甲基化调节因子的相关性变化可能是反映外部差异的内在特征。从图1I,J可以观察到不同m6A RNA甲基化调节因子之间不的关系。大多数调节因子之间的关系是正相关的,尤其是YTHDC1,它与其他调节因子之间的关系最为密切(图1I,J)。

图1

2. 识别两组不同临床特征的GBM样本

基于13个调节因子的表达相似性,当聚类稳定性数据集从k=2-10增加时,k=2是最理想的(图2A-C)。聚类分析的热图结果显示,13个调节因子可以区分不同的样本,并且同一个聚类中的样本具有很高的相关性(图2C)。主成分分析结果表明RM1和RM2亚组间转录谱存在明显的差异(图2D)。聚类样本的Kaplan-Meier生存分析结果显示RM2亚组的OS明显低于RM1亚组,表明13个甲基化调节因子可以评估GBM样本的预后(图2E)。

进一步研究发现RM1亚组与诊断时的年龄(P<0.05)、神经或神经前亚型(P<0.001)和GCIMP状态(图2F)显著相关。RM2亚组主要包括年龄较大的GBM、典型或间充质亚型、G-CIMP+状态。

图2

3. 基于一致聚类分析的分类功能注释

为了更好地了解GBM恶性肿瘤与13个m6A RNA甲基化调节因子之间的机制,通过差异分析,共有2299个基因(599个基因上调,1700个基因下调)被鉴定为DEGs(图3A)。对DEGs进行GO和KEGG富集分析,前10个GO term表明,上调的基因在中性粒细胞介导的免疫、细胞增殖、细胞连接、吞噬和细胞基质粘附等恶性肿瘤相关过程中富集(图3B)。

KEGG途径分析前10项证实上调基因与肌动蛋白骨架途径、局灶性粘附途径、癌途径中的蛋白多糖和FcγR介导的吞噬途径的调节有关(图3C)。此外,GSEA表明KRAS信号、炎症反应、肌生成和IL-6/JAK/STAT3信号与RM2亚组显著相关(图3D-G)。所有这些结果都证明了一致聚类分析得出的两个分类与GBM的恶性程度密切相关。

图3

4. GBM中靶向恶性肿瘤相关途径和生物学功能的新候选化合物

将一致性聚类的DEGs提交到CMap数据库。图4总结了能够抑制上述GBM基因表达的前89种化合物。通过CMap作用模式(MoA)分析揭示了170种机制。

图4

5. 识别与分析与GBM不良预后相关的m6A基因

这里研究了TCGA数据库中每个上调基因对GBM患者生存时间的意义。通过绘制Kaplan-Meier生存曲线,在RM2亚组的599个上调DEGs中,共有79个DEGs能够预测较差的OS(图5)。为了了解79个具有预后价值的基因与13个m6A RNA甲基化调节因子之间的相互作用,利用STRING数据库分析了它们之间的PPI。该网络由四个模块组成,共有88个节点和527个边,这表明在这个PPI网络中存在紧密的交互(图6A)。在88个节点中,筛选出54个中心节点基因,筛选度>10。最显著的10个节点度基因是ITGAM、STAT3、SPI1、TNFRSF1B、MYO1F、SLC11A1、TCIRG1、RAP2B、FERMT3和LCP1。28个节点和165个边包含在ITGAM模块中,其中STAT3、SPI1、TNFRSF1B、SLC11A1和FERMT3是显著的节点,因为它们与该模块中的其他节点的连接最多(图6B)。在RAP2B模块中,在该网络中形成了涉及6个节点的8条边(图6C)。此外,通过GO分析预测了ITGAM模块的功能。它与剪接体剪接、mRNA甲基化和氧化性单链RNA去甲基化的生物学过程有关。以上结果表明,m6A调节因子参与了恶性肿瘤相关的关键生物调控网络。
图5
图6

6. m6A-RNA甲基化调控因子的预后价值

对m6A RNA甲基化调控因子的表达谱数据进行单因素Cox回归分析。结果表明,13个基因中有4个与预后显著相关(HNRNPC、ALKBH5和ZC3H13是危险基因,HR>1, FTO是保护基因,HR<1)(图7A)。

利用LASSO回归分析筛选出具有独立预后价值的上述基因(NRNPC、ALKBH5和ZC3H13)作为候选基因。基于最低标准的回归系数用于评估GBM患者的风险评分,所选基因特征的系数分别为-0.014623、0.017905和-0.08661(图7B、C)。GBM患者根据风险评分中位数分为低风险亚组和高风险亚组。对这两个危险亚组与临床特征之间绘制热图(图7D)。在热图中,高风险和低风险亚组在IDH1状态(P<0.001)、年龄(P<0.001)、分子亚型(P<0.001)和RM1/2亚组(P<0.001)方面存在显著差异。

为了评估风险评分模型的预测准确性,使用ROC曲线并计算AUC。在预测模型的2年ROC曲线中,AUC为0.701(图7E)。对于分子表型,如IDH1和GCIMP状态,风险模型也表现得相对较好,AUC分别为0.821和0.733(图7F、G)。间充质和前神经的亚组分析也有类似的趋势,AUC分别为0.703和0.764(图7H,I)。此外,在RM1/2亚组分析中,风险评分模型的预测能力显著提高,AUC为0.887(图7J)。高危组的患者比低危组患者生存期更短(P<0.05)(图7H)。

进一步对TCGA数据集进行单变量和多变量Cox比例风险回归分析,以确定风险特征是否是独立的预后因素。经单因素Cox分析,年龄(HR=1.033,P<0.001)和风险评分(HR=11.899,P<0.001)均与OS相关,而GBM亚型和性别则与OS无关(图7L)。当将这些因素纳入多变量Cox比例风险回归(图7M)时,也观察到类似的风险评分趋势。结果显示年龄和风险评分是TCGA-GBM数据集中独立的预后因素。

图7

7. METTL3和METTL14在正常脑组织中的低表达

根据本文的研究结果和文献证实,METTL3在GBM中特异性地过表达,并且与GBM的发生显著相关。为了全面了解METTL3的功能,分别从GTEx和GEPIA数据库检索了不同部位的健康组织和肿瘤组织的表达水平,发现METTL3在大脑中的表达值低于生物体内的其他组织(图8A)。除GBM外,大多数肿瘤中METTL3的表达水平低于相应的健康组织(图8B)。这些结果表明METTL3的高表达可能是GBM的一个驱动因子,在GBM中起重要作用。同时搜索METTL14的表达谱并发现了相同的趋势。
图8
结语

m6A-RNA甲基化是一种最常见的mRNA修饰形式,由于它在GBM中的作用机制尚不明确,因此本文以此为切入点,分别从表达、潜在功能、预后价值三个方面展开。今后我们在构思文章时,也可以参照本文的思路,从一些未知或很少有人研究的点去入手,分层次的展开分析,发高分文章不是问题!!

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