董民团队发现索氏梭菌致死毒素TcsL的细胞受体 ​

索氏梭菌Paeniclostridium sordellii,以前称为Clostridium sordellii是一种厌氧孢子生成菌,其毒力菌株可在人和动物中引起致命性感染。在人类中可导致水肿、坏疽、低血压和全身中毒性休克,死亡率约为70%。妇女因妇科手术、分娩、流产等感染风险最高,宫内感染的死亡率接近100%。索氏梭菌的主要毒力因子是两种外毒素,致死毒素TcsL(约270kDa)和出血性毒素TcsH(约300kDa),其中以TcsL更为重要。这两种毒素均属于大型梭菌毒素(Large Clostridial Toxin,LCT)家族,其它还包括艰难梭菌(C. difficile毒素TcdA和TcdB,产气荚膜梭菌(C. perfringens毒素TpeL,和诺维氏梭菌(C. novyi毒素Tcn。在所有LCT中,TcsL的致死率最高。数据表明肺血管内皮细胞是TcsL在体内的主要病理靶点。通常细胞受体决定了毒素的细胞和组织特异性,目前,是否存在TcsL的特异性受体尚不清楚。

2020年4月16日,哈佛医学院波士顿儿童医院董民教授团队在Cell Host & Microbe 杂志上发表了题为 Genome-Wide CRISPR Screen Identifies Semaphorin 6A and 6B as Receptors for Paeniclostridium sordellii Toxin TcsL 的研究长文。文章通过CRISPR-Cas9介导的全基因组敲除文库筛选及体外体内功能实验证实了TcsL通过识别细胞表面的脑信号蛋白(Semaphorin)6A和6B(SEMA6A和6B)来特异性识别并入侵细胞,发挥其病理生理功能。阻断TcsL-SEMA相互作用为体内中和TcsL和降低索氏梭菌感染的高病死率提供了一种潜在的治疗方法。

首先,作者通过应用人肺癌细胞系A549进行了CRISPR-Cas9介导的全基因组敲除文库筛选。文库中的每个细胞都会表达某一特定sgRNA并靶向某一特定基因。当加入TcsL进行多轮筛选后,存活下来的具有抗性的细胞通常失活了一些基因,这部分基因对毒素毒杀细胞过程起到重要作用,并可以通过高通量测序进行检测。其实在最终的测序结果中,SEMA6A和6B拷贝数并不十分突出。作者考虑到有可能是受体冗余现象在作祟。简单来说,当毒素可以利用多个功能互补的受体入侵细胞时,单一受体敲除并不足以对细胞产生足够的抗性,因而无法在最终筛选结果中富集足够多的拷贝数。于是作者对测序结果进行了二次筛选,将细胞表面定位的蛋白重新排序。其中,SEMA6A是候选受体中分数最高的。这一分析为今后操作同类筛选并解决基因冗余问题提供了新的思路。

在接下来的细胞生物学研究中,作者发现在多种不同的人类细胞模型(包括上皮细胞系和原代内皮细胞)中,同时敲除或干扰SEMA6A和6B的表达会降低细胞对TcsL的敏感性;而过表达SEMA6A或者6B则会增加其敏感性。加入重组纯化的SEMA6A或者6B的胞外结构域(extracellular domain,ECD)可以竞争性抑制TcsL的细胞毒性。而其他SEMA6家族成员以及其他SEMA家族的代表则没有同样的性质。因此,作者推论SEMA6A和6B为TcsL的共受体,这也验证了作者之前对于受体冗余的猜想。

接下来,作者利用生物膜层光学干涉技术(biolayer interferometry,BLI)来表征TcsL-SEMA相互作用。作者发现SEMA6A和6B可以与TcsL产生较强的相互作用,而其他SEMA6家族成员以及其他SEMA家族的代表则不能结合TcsL。这一结果与细胞生物学实验相符合。在所有的LCT中,TcsL与TcdB的相似性最高(70%序列一致性)。TcdB的细胞受体为人卷曲受体(Frizzled,FZD)家族蛋白,二者通过TcdB的卷曲受体结合域(Frizzled binding domain,FDB)相互作用。同时作者发现,TcsL上与TcdB-FBD同源的一段序列(氨基酸残基1285-1804)介导了其与SEMA的相互作用。有趣的是,在TcsL和TcdB之间交换受体结合域可以切换它们受体结合的特异性。

图1. TcsL-SEMA相互作用

最后,作者利用小鼠模型验证了SEMA6A-ECD蛋白可以在体内降低TcsL对小鼠的肺组织损伤和致死率。这些发现进一步证实了SEMA6A和6B是TcsL的受体,且与其病理生理功能密切相关。

哈佛医学院波士顿儿童医院田松海博士为本文第一作者。吉林大学第一医院刘杨博士参与了小鼠实验。哈佛医学院波士顿儿童医院董民教授为通讯作者。值得注意的是,在本文投稿并送审后,在生物预印本服务器bioRxiv上上传了一篇背靠背文章(https://www.biorxiv.org/content/10.1101/871707v1.full ),与本文的主要发现几乎完全相同。

董民教授实验室常年致力于肉毒杆菌毒素(Botulinum neurotoxins)及其他细菌外毒素致病机理及应用的研究。近年来利用CRISPR-Cas9介导的全基因组敲除文库筛选技术连续发表多篇论文,揭示了不同毒素的细胞受体及致病机理。除本文的TcsL外,还包括TcdB【1】、TcdA【2】、志贺毒素(Shiga toxin)【3】以及蓖麻毒素(ricin)【3】等。这些发现极大推动了领域对于传染病菌致病机理的认知,并对于开发潜在治疗手段提供了新思路。

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.03.007
1. Tao L, Zhang J, Meraner P, Tovaglieri A, Wu X, Gerhard R, Zhang X, Stallcup WB, Miao J, He X, Hurdle JG, Breault DT, Brass AL, Dong M. Frizzled proteins are colonic epithelial receptors for C. difficile toxin B. Nature, 538(7625):350 (2016).

2. Tao L*, Tian S*, Zhang J*, Liu Z, Robinson L, Miyashita S-I, Breault DT, Gerhard R, Whelan S, Dong M. Sulfated glycosaminoglycans and low-density lipoprotein receptor contribute to Clostridium difficile toxin A entry into cells. Nature Microbiology, 4(10):1760 (2019).

3. Tian S, Muneeruddin K, Choi MY, Tao L, Bhuiyan RH, Ohmi Y, Furukawa K, Furukawa K, Boland S, Shaffer SA, Adams RM, Dong M. Genome-wide CRISPR screens for Shiga toxins and Ricin reveal Golgi proteins critical for glycosylation. PLoS Biology, 16(11):e2006951 (2018).

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