索氏梭菌（Paeniclostridium sordellii，以前称为Clostridium sordellii）是一种厌氧孢子生成菌，其毒力菌株可在人和动物中引起致命性感染。在人类中可导致水肿、坏疽、低血压和全身中毒性休克，死亡率约为70%。妇女因妇科手术、分娩、流产等感染风险最高，宫内感染的死亡率接近100%。索氏梭菌的主要毒力因子是两种外毒素，致死毒素TcsL（约270kDa）和出血性毒素TcsH（约300kDa），其中以TcsL更为重要。这两种毒素均属于大型梭菌毒素（Large Clostridial Toxin，LCT）家族，其它还包括艰难梭菌（C. difficile）毒素TcdA和TcdB，产气荚膜梭菌（C. perfringens）毒素TpeL，和诺维氏梭菌（C. novyi）毒素Tcn。在所有LCT中，TcsL的致死率最高。数据表明肺血管内皮细胞是TcsL在体内的主要病理靶点。通常细胞受体决定了毒素的细胞和组织特异性，目前，是否存在TcsL的特异性受体尚不清楚。
2020年4月16日，哈佛医学院波士顿儿童医院董民教授团队在Cell Host & Microbe 杂志上发表了题为 Genome-Wide CRISPR Screen Identifies Semaphorin 6A and 6B as Receptors for Paeniclostridium sordellii Toxin TcsL 的研究长文。文章通过CRISPR-Cas9介导的全基因组敲除文库筛选及体外体内功能实验证实了TcsL通过识别细胞表面的脑信号蛋白（Semaphorin）6A和6B（SEMA6A和6B）来特异性识别并入侵细胞，发挥其病理生理功能。阻断TcsL-SEMA相互作用为体内中和TcsL和降低索氏梭菌感染的高病死率提供了一种潜在的治疗方法。
首先，作者通过应用人肺癌细胞系A549进行了CRISPR-Cas9介导的全基因组敲除文库筛选。文库中的每个细胞都会表达某一特定sgRNA并靶向某一特定基因。当加入TcsL进行多轮筛选后，存活下来的具有抗性的细胞通常失活了一些基因，这部分基因对毒素毒杀细胞过程起到重要作用，并可以通过高通量测序进行检测。其实在最终的测序结果中，SEMA6A和6B拷贝数并不十分突出。作者考虑到有可能是受体冗余现象在作祟。简单来说，当毒素可以利用多个功能互补的受体入侵细胞时，单一受体敲除并不足以对细胞产生足够的抗性，因而无法在最终筛选结果中富集足够多的拷贝数。于是作者对测序结果进行了二次筛选，将细胞表面定位的蛋白重新排序。其中，SEMA6A是候选受体中分数最高的。这一分析为今后操作同类筛选并解决基因冗余问题提供了新的思路。
在接下来的细胞生物学研究中，作者发现在多种不同的人类细胞模型（包括上皮细胞系和原代内皮细胞）中，同时敲除或干扰SEMA6A和6B的表达会降低细胞对TcsL的敏感性；而过表达SEMA6A或者6B则会增加其敏感性。加入重组纯化的SEMA6A或者6B的胞外结构域（extracellular domain，ECD）可以竞争性抑制TcsL的细胞毒性。而其他SEMA6家族成员以及其他SEMA家族的代表则没有同样的性质。因此，作者推论SEMA6A和6B为TcsL的共受体，这也验证了作者之前对于受体冗余的猜想。
接下来，作者利用生物膜层光学干涉技术（biolayer interferometry，BLI）来表征TcsL-SEMA相互作用。作者发现SEMA6A和6B可以与TcsL产生较强的相互作用，而其他SEMA6家族成员以及其他SEMA家族的代表则不能结合TcsL。这一结果与细胞生物学实验相符合。在所有的LCT中，TcsL与TcdB的相似性最高（70%序列一致性）。TcdB的细胞受体为人卷曲受体（Frizzled，FZD）家族蛋白，二者通过TcdB的卷曲受体结合域（Frizzled binding domain，FDB）相互作用。同时作者发现，TcsL上与TcdB-FBD同源的一段序列（氨基酸残基1285-1804）介导了其与SEMA的相互作用。有趣的是，在TcsL和TcdB之间交换受体结合域可以切换它们受体结合的特异性。
图1. TcsL-SEMA相互作用
最后，作者利用小鼠模型验证了SEMA6A-ECD蛋白可以在体内降低TcsL对小鼠的肺组织损伤和致死率。这些发现进一步证实了SEMA6A和6B是TcsL的受体，且与其病理生理功能密切相关。
哈佛医学院波士顿儿童医院田松海博士为本文第一作者。吉林大学第一医院刘杨博士参与了小鼠实验。哈佛医学院波士顿儿童医院董民教授为通讯作者。值得注意的是，在本文投稿并送审后，在生物预印本服务器（bioRxiv）上上传了一篇背靠背文章（https://www.biorxiv.org/content/10.1101/871707v1.full ），与本文的主要发现几乎完全相同。
董民教授实验室常年致力于肉毒杆菌毒素（Botulinum neurotoxins）及其他细菌外毒素致病机理及应用的研究。近年来利用CRISPR-Cas9介导的全基因组敲除文库筛选技术连续发表多篇论文，揭示了不同毒素的细胞受体及致病机理。除本文的TcsL外，还包括TcdB【1】、TcdA【2】、志贺毒素（Shiga toxin）【3】以及蓖麻毒素（ricin）【3】等。这些发现极大推动了领域对于传染病菌致病机理的认知，并对于开发潜在治疗手段提供了新思路。
2. Tao L*, Tian S*, Zhang J*, Liu Z, Robinson L, Miyashita S-I, Breault DT, Gerhard R, Whelan S, Dong M. Sulfated glycosaminoglycans and low-density lipoprotein receptor contribute to Clostridium difficile toxin A entry into cells. Nature Microbiology, 4(10):1760 (2019).
3. Tian S, Muneeruddin K, Choi MY, Tao L, Bhuiyan RH, Ohmi Y, Furukawa K, Furukawa K, Boland S, Shaffer SA, Adams RM, Dong M. Genome-wide CRISPR screens for Shiga toxins and Ricin reveal Golgi proteins critical for glycosylation. PLoS Biology, 16(11):e2006951 (2018).
