文献解读:TP63泛癌研究

素有“基因组卫士”之称的抑癌基因TP53在调控细胞周期、细胞凋亡和维持基因组稳定过程中的重要性,相信大家是早就熟知了的。今天,小编跟大家分享的这篇文章是关于它的家族成员TP63的,TP63有多种异构体(即基因的可变剪接产生不同的转录本),这些异构体根据其N端转录起点的不同分为两种:较长TA异构体和较短DN异构体(DNp63TAp63)TA异构体能抑制细胞的无限增殖,而DN异构体则会促进细胞的生长和迁移,并可以拮抗TP53蛋白和TA异构体的功能。
 
TP63 isoform expression is linked with distinct clinical outcomes in cancer
TP63异构体表达与癌症不同临床结果的关联
 
目前,已知TP63在人类膀胱癌中是普遍表达的,这篇文章就利用TCGA中的数据综合分析了TP63异构体的表达及其与膀胱癌和其他人类癌症的关系。该研究发现,DNp63异构体在癌症中表达最普遍,其高表达通常预示着较好的结果,而TAp63的表达则与较差的临床结果相关。下面,咱们详细看一下作者的分析流程和研究结果。
 
数据和方法
数据获取与处理
作者首先下载了TCGA29种疾病的双端RNA测序数据(删除了4种数据集为单端测序的疾病)以及病人的临床数据;然后将膀胱尿路上皮癌(BLCA)数据读段通过STARv2.5.2比对到hg38参考基因组,并用Cufflinksv2.2.1识别潜在的TP63新异构体;同时,对所有29种疾病的测序数据用Salmonv0.11.3进行比对和量化(校正序列、GC和位置偏差)TPM值的标准化方法为上四分位数,z-score值用log2 TPM计算所得;最后,对于每位患者,通过将某一种特定异构体的所有转录信号进行加和来构建TP63异构体分组。
 
统计方法
数据的统计分析和可视化都是基于R完成的。首先,作者用Cox比例风险回归模型分析了TP63基因以及异构体的表达同TCGA泛癌数据集中患者的生存之间的关系;然后,通过计算患者群体表达值的五个阈值:第510509095百分位数,患者被分为高、低TP63基因及异构体表达组,并利用KM图进行可视化。
 
作者通过一个加权模型从GSEA提供的基因集数据库MSigDB中下载了v6版基因集,并用Wilcoxon检验所得的log10p将基因做了排秩,以量化患者基因表达的差异性。FDR<=0.05的基因集认为是显著的,此外,作者还从HPRD数据库获取了蛋白互作数据。
 
cDNA提取及其他分析
文章使用到的膀胱癌细胞系有253JUM-UC5UM-UC14UM-UC13UM-UC10,作者最终获得了它们的RNA。并且,对于未注释的TP63异构体,作者还做了PCR验证以及免疫印迹该过程小编就不在此赘述了。
 
结果
TP63基因在泛癌中的表达及与生存的关系
作者将29种疾病,总计8519名患者的RNA-Seq和临床数据进行了标准化处理,以综合分析TP63基因的表达同患者结果之间的关系。跟已有的研究结果一致,作者发现在鳞状组织学相关癌症中(宫颈癌、肺鳞癌等)TP63均表现出高表达,在膀胱癌中其次(1.a)。通过Cox回归分析,研究发现TP63较高水平的表达与胶质瘤、皮肤黑色素瘤和胰腺癌生存变短显著相关,而在乳腺癌、肺鳞癌和膀胱癌中情况则相反(1.b)。在BLCA样本集中,TP63的表达是双峰的,大部分是高表达(1.c),而且这些高表达的患者,他们的平均总生存期(OS)显著高于低表达患者(1.d)

 图1. TP63表达的泛癌分析
 
膀胱癌中TP63异构体的识别
基于已有研究,作者假设TP63的差异效应可能与TP63异构体表达的多样性有关。为了构建一个比较全面的TP63异构体集合,作者从RefgeneGencode数据库获得了相关的注释信息(共挖掘出13TP63异构体);并用de novo异构体挖掘方法识别了未注释的TP63异构体(基于Cufflinks)DNp63alphaPDNp63betaP,作者通过PCR证实了它们在膀胱癌中的表达,因此,最终确定了15TP63异构体(2)

 2. 膀胱癌中TP63异构体的识别
 
TP63异构体表达的量化
作者用Salmon方法将单个亚型在膀胱癌以及其他癌症中的表达进行了量化。在膀胱癌中,多数为DNp63组的异构体(3.a),在一组独立的原发性膀胱癌样本集和膀胱癌细胞系中,作者也观察到了相似的表达模式(3.b-c),而且在这三组数据集中,DNp63alphaDNp63beta要稍稍高于其他亚型。在其他癌症中,TP63异构体具有类似的表达模式,表明了这种量化的非特异性。接下来,作者又分别用定量PCR和实时定量PCR证实了Salmon量化方法可以准确反应TP63异构体的相对表达、准确定量alpha, betadelta TP63的比例,并一致发现alpha最丰富(3.d-g)
 
该研究对所有TP63TP63alpha异构体做了免疫印迹,以比较蛋白质和mRNA水平的表达是否相似(3.h),同作者预期的一样,所有条带都对应着DNp63亚型(3.b)。在UM-UC5UC14细胞系中,DNP63α异构体的表达定量分别占总TP63 mRNA90%91%,蛋白表达定量也分别占了84%80%。这些结果证实了用Salmon定量可以准确预测TP63异构体的表达,并且DNp63α是膀胱癌中最主要的TP63异构体。在TCGA中的其他肿瘤中,大多数具有一样的TP63异构体图谱(3.i)

 图3. TP63异构体表达的量化
 
膀胱癌亚型中的TP63异构体表达
为了确定TP63异构体的表达在膀胱癌各分子亚型中是否不同,作者分析了TP63在基底鳞状、官腔乳突状、管腔浸润、管腔和神经内分泌这五种亚型中的表达(图4.a)。结果发现DNp63组在基底鳞状以及官腔乳突状亚型中的表达要高于其他三种(4.b),而且基底组患者的TAp63表达明显高于官腔患者(4.c),这表明了DNp63TAp63TCGA分子亚型中可能具有不同的表达水平。

 图4.膀胱癌分子亚型中TP63异构体的表达
 
然后,作者又分析了单个TP63异构体与患者生存之间的关系,并对DNp63TAp63做了比较。BLCA DNp63阳性和阴性组的KM生存曲线表明阳性组患者的总生存期要高于阴性组;而且,DNp63alphaP阳性组患者的总体生存率也有所提高(5.a),在BRCALUSC数据集中也获得了相似的结果。
 
根据TAp63异构体表达的有无将患者分为两组后,作者发现TAp63TAp63beta高表达的患者其OS显著低于无/低表达患者(2.b)BRCALUSC数据集中同样观察到了相似的结果。前面咱们已经说过,TP63基因表达与存活的关系和膀胱癌分子亚型有关,类似地,DNp63表达与官腔患者的风险降低显著相关,而TAp63则与基底鳞状亚型患者的危险增加显著关联(5.c)。多变量Cox回归分析的结果表明,临床因素中只有年龄以及病理分期与生存有关,在控制这两个变量时,DNp63的高表达依旧与生存率的提高有关,而且TAp63的高表达也同样与死亡风险的增加显著相关(5.d),这表明了DNp63TAp63的表达作为膀胱癌独立预后因子的可能性。

 图5. TP63异构体的表达与生存相关
 
接下来,作者又对整个TCGA泛癌群体做了单变量Cox比例风险回归分析,发现了DNp63BRCABLCALUSCHR增加之间的关联,证实了上面的结果。由于DNp63TAp63表达与生存的关系是相反的,因此研究假设TP63HR的关联可能是由这两种异构体相对丰度的变化决定的。作者将整个TCGA肿瘤群体进行了分组(6.c-d),由图可知,具有较高TP63相关风险的患者,具有较低的DNp63比例以及较高的TAp63比例。

6. DNp63TAp63与生存的关系
 
DNp63TAp63异构体相关的信号通路
已有研究表明DNp63TAp63可以促进预后相关的转录过程,因此,作者使用五分位数法,基于DNp63TAp63的表达水平分别将BLCABRCALUSC患者进行分层。然后用符号Wilcoxon p对基因进行排秩做GSEA,识别出在每个异构体表达水平较高的组中显著富集的基因集。由图7的富集结果,可知高水平DNp63的患者富集到了表皮细胞分化、角化和皮肤发育相关的基因,TAp63则富集到了与适应性和先天免疫反应、VEGF信号、Jak-Stat信号和其他几种转录因子相关的基因集这意味着DNp63TAp63不同的转录和信号通路有关。

 图7. 基因富集分析
 
总的来说,作者挖掘出了15种TP63异构体,比较了它们在膀胱癌各亚型中的表达水平,并对TAp63DNp63异构体做了生存分析以及富集分析,发现了它们与患者生存期之间的关系是相反的,其富集的生物学过程也是不同的。这篇文章的创新之处在于首次对TP53异构体表达进行了泛癌分析,但是用到的生物信息学方法都比较简单,也没什么太多的套路,希望大家看完能有所收获呀!
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