文献解读:自噬怎么研究

前面跟大家一起学习了干细胞、外泌体、RNA甲基化的相关文献,有小伙伴在后台留言希望能分享一些其他热点的文献,比如自噬、焦亡等等,另外还有一些小伙伴希望能解读各个专业的文献,比如神经疾病、心血管疾病等等,大家别着急,我会尽力满足大家的需要,争取能把各个专业、各种热点的高质量文献都拿出来跟大家一起解读分享。

应前面小伙伴的要求,今天就解读一篇神经系统疾病相关的文献,同时也是一篇自噬相关研究的文献,影响因子虽然不高,但是对于0基础的小伙伴读起来稍微简单点,不像前面的文章那么晦涩难懂。

这篇文章的题目是:Homocysteineenhances neural stem cell autophagy in in vivo and in vitromodel of ischemicstroke,在体内外的缺血性卒中模型中,同型半胱氨酸提高了神经干细胞自噬。2019年发表在Cell Death & Disease杂志,当前影响因子是5.959这个杂志也是个老牌杂志了,最近4年的影响因子都在5分以上。

先来看研究背景:

主要交待了6个方面的内容:

1.缺血性卒中跟神经干细胞(NSCs)的关系,提出微环境在NSCs中的作用至关重要。

2.同型半胱氨酸(Hcy)跟神经系统疾病以及NSCs的关系。

3.自噬的背景以及与神经系统的关系。

4.Hcy跟自噬的关系。

5.PI3K-Akt和ERK依赖的mTOR信号通路与自噬的关系。

6.本研究的目的:通过OGD/R细胞模型和脑缺血再灌注模型,阐明自噬在Hcy对NSCs毒性作用中的作用。另外在Hcy和OGD/R联合调节自噬活性的过程中,还研究了PI3K-Akt和ERK依赖的mTOR通路在其中的作用。

通过背景就可以了解到这篇文章的关键内容:

1.疾病:脑卒中

2.疾病相关细胞:神经干细胞

3.研究水平:细胞+动物

4.机制研究:自噬;PI3K-Akt和ERK依赖的mTOR信号通路

研究方法:

这篇文章分别从体内和体外进行验证,先做的动物实验,用的是MCAO法制作的SD大鼠脑卒中模型,按照分组(假手术组,MCAO组,MCAO+Hcy组,MCAO+Hcy+3MA组,MCAO+3MA组)分别给予Hcy(同型半胱氨酸)和3MA(自噬抑制剂)处理。细胞实验是培养的NSCs,暴露在缺氧或富氧条件下(OGD/RO),分别给予Hcy、3MA(自噬抑制剂)、MHY1485(mTOR激动剂)、TPA和CUR(两个都是ERK激动剂)、IGF-1(PI3K激动剂)处理。然后进行了MTT分析、LDH释放检测、自噬的电镜观察、Western-blot和免疫荧光检测。

我们来看研究结果:

1:3MA对Hcy诱导的暴露于OGD/R的神经干细胞毒性的影响。

A三种浓度(0.050.10.5mM3MA作用72h后,用MTT法检测细胞活性。结果显示Hcy能明显减低细胞的活性,0.1mM3-MA能显著减少Hcy对细胞的毒性作用。

B培养基中LDH的测定来评价细胞的坏死。结果显示3-MA能显著减少Hcy引起的细胞坏死。

CWestern-blot检测了细胞凋亡蛋白PARPcaspase 3的表达。结果显示HcyNSCs中这2个细胞凋亡蛋白的表达没有显著影响,提示NSCsHcy处理后可能经历的是自噬性死亡。

 

2.暴露于OGD/RHcy处理的NSCsLC3Beclin 1的表达及自噬的超微结构。

A和B:主要检测了Hcy处理后NSCs中自噬蛋白Beclin1、LC3的表达。结果显示Hcy能显著提高Beclin1的表达和LC3II/LC3I的比值。

C: Hcy处理后电镜下观察自噬体的形成。

 

上面2个部分都是细胞试验,主要是证明了在Hcy处理的暴露于OGD/RNSCs中自噬是增高的,而3MA能阻断自噬,提高NSCs活性。

 

3. Hcy增加了脑缺血再灌注损伤后侧脑室室下区(SVZNSCsLC3的表达。

 

A:术后3天和7天各实验组SVZ内LC3(绿色)和Nestin(红色)双免疫荧光染色的图像。结果显示Hyc处理显著提高了SVZ中LC3的表达,而3MA能阻断Hyc的作用。

B:免疫荧光检测各组SVZ的NSCs中LC3阳性数量。绿色,LC3染色;红色,Nestin染色;黄色,LC3与Nestin共定位。自噬体见图中点状结构(白色箭头)。结果显示Hyc处理显著提高了SVZ的NSCs中LC3的表达,而3MA能阻断Hyc的作用。

 

4. Hcy通过抑制mTOR磷酸化促进暴露于OGD/RNSCs自噬。

A:Western-blot检测了mTOR蛋白和磷酸化蛋白的表达。结果提示Hcy能抑制NSCs中mTOR磷酸化。

B和C: Western-blot检测了自噬蛋白Beclin1LC3的表达。结果显示Hcy能提高上述蛋白表达,而MHY1485mTOR激动剂)能降低上述蛋白的表达,阻断Hcy的作用。

D:各组电镜观察自噬体。结果显示Hcy能促进自噬,MHY1485能抑制Hcy诱导的自噬。

 

5.Hcy通过抑制ERK-mTOR信号通路促进暴露于OGD/RNSCs自噬。

A: Western-blot检测ERK的磷酸化情况。结果显示Hcy抑制了ERK的磷酸化。

BC:Western-blot检测mTOR的磷酸化情况。结果显示Hcy抑制了mTOR的磷酸化,ERK激动剂CURTPA都会促进mTOR磷酸化,拮抗Hcy的作用。

 

6. Hcy通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路促进暴露于OGD/RNSCs自噬

AB: Western-blot检测NSCsPI3KAKT的磷酸化情况。结果显示Hcy抑制了PI3K-AKT的磷酸化。

CD:Western-blot检测NSCsAKTmTOR的磷酸化情况。结果显示Hcy抑制了AKTmTOR的磷酸化,PI3K激动剂IGF-1可促进AKTmTOR的磷酸化,拮抗Hcy的作用。

 

7. Hcy处理后脑卒中模型中自噬激活的信号通路示意图

结果总结:这个研究证明了伴有高同型半胱氨酸的缺血性损伤诱导了自噬的过度激活,并通过PI3K-AKT和ERK依赖的mTOR信号通路抑制了SVZ中NSCs的细胞活性。

 

这篇文章看起来不是很难,对我们新手来说主要是学习一下几个点:

1. 对于疾病的发病机制研究,动物和细胞水平结合起来研究是比较全面的,现在5分的文章如果只有一个水平的研究挺难发表。

2. 脑卒中的基础实验造模方法:动物实验是MCAO造模,细胞实验是通过暴露于OGD/R构建模型。

3.神经干细胞的研究方法:这篇文章可以借鉴,比如体外培养的方法,动物水平的观察等。

4. 自噬的研究方法:自噬是一种区别于凋亡的细胞死亡方式,是近几年的研究热点,检测方法主要包括以下4个方面:①电镜观察自噬体形成;②检测自噬蛋白Beclin1和LC3的表达,Beclin1表达升高和LC3II/LC3I比例升高表明自噬激活;③免疫荧光检测LC3阳性细胞。④自噬激活剂和抑制剂的使用(本文用了自噬抑制剂3MA,自噬激活剂常用的是Rapamycin

5. 机制模式图的重要性,在文章最后有一张总结的机制图是可以加分的,至于怎么画,用PPT或者AI都是可以搞定的。

 

对这篇文章,在结果的展示中其实还有些缺陷:

1. 在添加各种信号通路激活剂后(也就是5和6两个部分)只是用Western-blot检测了mTOR的磷酸化,而没有用上面的自噬检测方法检测细胞中自噬的变化如果我是审稿专家,我会提出需要补充这部分的结果。

2. WB条带对比度、亮度都不一样,我们在整理数据的时候要注意图片的一致性。

这篇文章同样可以凝练成一个课题,申请省市级的项目或者国自然青年基金也是完全足够的:

  • 神经干细胞自噬在Hcy加重缺血性卒中损伤中的作用及机制研究
  • 高Hcy诱导神经干细胞自噬加重缺血性损伤的作用及机制研究
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