蛋白纯化实验怎样选择合适的配基和金属离子?

固定化金属亲和层析(IMAC)是蛋白纯化的常用方法,特别适用于纯化多组氨酸(His)标签融合蛋白。金属离子通过螯合剂(配体)固定到基质上,与多组氨酸标签相互作用,有效的螯合样品中的融合蛋白。氮川三乙酸(NTA)和亚氨基二乙酸(IDA)是商业化树脂中经常使用的螯合配基。怎样选择合适的配基和金属离子,应用于蛋白纯化实验呢?

首先,我们比较一下NTA和IDA。NTA是4价结构,IDA是3价结构,NTA比IDA多一个羧甲基。结构上的不同,使得NTA比IDA更稳定,能得到更高纯度的目标蛋白。IDA更小,使得它与基质更紧密的结合,提高了载量,但同时也导致了更多的非目标蛋白的结合,但IDA相对便宜。

His标签蛋白纯化常用到的金属离子有Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+。与His的亲和度:Cu2+>Ni2+>Zn2+>Co2+;得到的目标蛋白纯度:Cu2+<Ni2+<Zn2+<Co2+

一些还原剂会影响IDA、NTA的性能。比如DTT会使金属离子从IMAC 树脂上剥落,常常会使树脂的颜色变为棕色;EDTA对配基的影响更大。但实验显示,NTA耐受各类化学试剂的能力明显优于IDA

总结起来,选用IMAC纯化蛋白前,得先问这几个问题:

1.蛋白纯度、蛋白载量,哪个是你的目标?

2.你的样本中是否包含一些还原试剂如DTT或EDTA?

3.你的预算是?

如果你只是想得到高的蛋白产量,对纯度的要求稍微低点,IDA结合的树脂可能是你正确的选择。如果想最大限度的减少非特异性结合,可以使用Zn2+ 或Co2+结合树脂。从各类数据来看,NTA结合树脂都表现出极大的优越性。而Ni-NTA树脂则相当于His标签蛋白纯化的行业标准!

不同的样本或许纯化的条件不尽相同,但以上最基本的原则不同样本都是适用的。

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