基于网络药理学的小柴胡汤治疗新型冠状病毒肺炎发热的可行性探讨

摘 要:目的  通过网络药理学和分子对接的方法,初步探讨小柴胡汤在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)治疗中缓解发热及抗病毒的可能作用机制。方法  运用网络药理学方法分析小柴胡汤治疗发热的潜在靶点及通路;从TCMSP、PharmMapper数据库收集小柴胡汤的成分和作用靶点;OMIM和Genecards数据库收集发热相关靶点;String数据库构建蛋白相互作用网络,分析核心靶点;DAVID数据库和KOBAS 3.0进行基因功能(GO)和基因通路(KEGG)富集分析;Cytoscape 3.2.7构建成分-靶点-通路网络图。运用分子对接技术筛选与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)以及SARS-CoV-2感染靶细胞关键受体血管紧张素转换酶II(ACE2)结合力较强的活性成分,预测可能的结合位点。结果  网络药理学分析表明,小柴胡汤共筛选出165种活性成分,预测到靶点168个,筛选出发热相关靶点7 006个,取交集得到小柴胡汤与发热相关的靶点141个。GO富集到基因功能292个,KEGG富集到基因通路30条。分子对接结果表明,小柴胡汤的主要活性成分与SARS-CoV-2和ACE2均有较强的结合能力,其中β-谷甾醇、豆甾醇和3′-羟基-4′-O-甲基葡萄糖苷为结合最强的3个有效成分。结论  网络药理学方法初步探讨了小柴胡汤缓解COVID-19发热的作用机制,β-谷甾醇、豆甾醇和3′-羟基-4′-O-甲基葡萄糖苷可能为小柴胡汤中主要发挥抑制SARS-CoV-2的成分,为进一步的研究提供了方向。

201912月开始,以湖北省武汉市为重点区域,在全国各省市范围内陆续发现多起新型冠状病毒引起的肺炎(简称新冠肺炎)病例,并迅速蔓延至许多境外国家和地区,成为继严重急性呼吸综合征(severe acute respiratorysyndromeSARS)和中东呼吸综合征(Middle East respiratorysyndromeMERS)之后,严重危害人民健康和公共安全的重大疫情之一。2020211日,国际病毒分类委员会(ICTV)正式将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2。世界卫生组织(WHO)也宣布将新型冠状病毒肺炎正式命名为coronavirus disease 2019COVID-19)。COVID-19因一种新发现的冠状病毒感染引发,以强传染性以及高流行性为特点,属中医的疫病范畴。由于目前尚无针对性特效药物,而中医药在疫病的预防和治疗方面积累了大量的经验,国家卫生健康委员会建立了中医药应对机制,组建了中医药专家队伍,在临床已经取得了明显成效。

从中医角度看,此病属疫病范畴,病因为外感疫疠之气,病位由表及里,是正气虚弱,邪毒壅肺所致。从其临床表现来看,此病的典型症状为发热、干咳和乏力,亦有患者伴心肌、消化道及神经系统问题。小柴胡汤源自汉代医家张仲景的《伤寒杂病论》,主治少阳病,少阳病位在半表半里之间,典型表现为口苦、咽干、目眩、往来寒热、胸胁苦满、默默不欲饮食,心烦喜呕,与COVID-19症状基本相符。在既往的研究报道中,小柴胡汤的主治症状以发热最为多见[1],尤其是感染性发热,此外对免疫系统发热及不明诱因发热等亦有疗效[2]。在应对本次COVID-19疫情中,许多地区采用了小柴胡汤来治疗。如2020126日广东省中医药局公布的关于新型冠状病毒肺炎的第一版试行方案,明确指出在COVID-19早期,应用霍朴夏苓汤合小柴胡汤加减方来化湿解毒,宣肺透邪;国家卫生健康委员会和国家中医药管理局联合发布的关于推荐在中西医结合救治新型冠状病毒感染的肺炎中使用清肺排毒汤的通知中,清肺排毒汤一方,也是由《伤寒杂病论》中的麻杏石甘汤、射干麻黄汤、小柴胡汤和五苓散4个经典方剂组合而成。从通知发出到使用至今,更大范围的实践,进一步证明了此方的医学价值。

中药复方以多成分多靶点多途径为最主要的特点,现有的研究手段不足以阐明其作用机制。网络药理学基于系统生物学的理论,对中药复方进行网络分析,来揭示多分子药物协同作用于人体的机制,与中医学的整体观不谋而合[3]。分子对接是通过受体和药物分子(配体)之间的相互作用方式,预测其结合模式和亲和力的一种计算机模拟方法[4]。本研究首先通过网络药理学筛选出小柴胡汤的活性成分,预测小柴胡汤治疗COVID-19发热的可能作用机制,并在此基础上运用分子对接技术初步研究小柴胡汤在COVID-19治疗中抗病毒的作用机制。

1 材料与方法

1.1 小柴胡汤活性成分虚拟筛选

通过检索中药系统药理学数据库和分析平台TCMSPhttp://ibts.hkbu.edu.hk/lsp/tcmsp.php),以柴胡”“黄芩”“半夏”“甘草”“人参”“生姜”“大枣作为关键词进行查询,并查阅文献验证检索出的成分,得到小柴胡汤的候选成分。传统中药多为口服制剂,在人体必然经过吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)、排泄(excretion)过程才能与靶器官、靶组织结合发挥药效,口服生物利用度(OB)是ADME的参数,OB30%的化合物,被认为可被人体吸收利用[5]。类药性(DL)是化合物成药的必需条件,DL值代表成分与已知化学药的相似性,一般认为DL0.18的成分对机体产生活性具有重要参考价值[6]TCMSP数据库中可以直接查询到每个化合物的OBDL值,页面带有过滤器,结合文献报道,用OB30%DL0.18进行筛选,得到小柴胡汤的有效成分。

1.2 潜在作用靶点预测和基因名注释

反向药效团搜索指通过预先构建好的含有多个药效团模型的药效团数据库,用单个分子结构去反向匹配,寻找与查询结构匹配较好的靶点。将“1.1”中得到的化学成分按名称输入到Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中,查询其3D结构,存储为.sdf格式。再上传到PharmMapper平台服务器(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/,该数据库整合了来自TargetBankDrugBankBindingDBPDTD数据库的数据,拥有超过7000个受体基础的药效团模型,包含1 627个药物和459个人类蛋白靶点的信息)。基于PharmMapper服务器的药效团匹配法[7],由该平台完成化学成分靶点的预测,从而得到有效成分作用的人源相关蛋白靶点。利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)规范与活性成分相关的靶点蛋白,获得靶点对应的基因名。

1.3 疾病靶点筛选

OMIM数据库(http://omim.org/)和Genecards数据库[8]https://www.genecards.org)中输入关键词“fever”,搜索与发热相关的疾病靶点。运用Venny平台(版本2.1http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)将小柴胡汤药效成分调控的靶点与发热的治疗靶点取交集,得到小柴胡汤治疗发热的交集靶点。

1.4 核心靶点的筛选及验证

String databasehttps://string-db.org)是一个搜索已知蛋白间相互作用关系的数据库[9]。将“1.3”得到的交集靶点导入String数据库,获取蛋白相互作用关系。蛋白节点的连线越多,连线越粗,表明与其他蛋白关联度越大,更有可能成为核心靶点。在RCSBhttps://www.rcsb.org/)数据库中下载核心靶点的立体结构,MAPK1PDB ID2OJG)、MAPK3PDBID2ZOQ)、IL-6PDBID1ALU)、TNFPDBID2AZ5)、VEGFAPDBID3BDY)和JUNPDBID5AEP)以.pdb格式进行保存,再与筛选出的前20个活性成分进行分子对接打分,验证二者是否能够较好结合。

1.5 Gene oncologyGO基因生物过程分析

将交集靶标导入DAVID数据库(http://www.david.niaid.nih.gov)中,进行基因功能GO富集分析。此数据库分别从细胞组成、分子功能及生物过程3方面提供基因功能的详细注释[10]。设定阈值p0.05q0.05进行筛选,对相互作用的靶点进行功能富集分析。

1.6 Kyoto encyclopedia of genes and genomesKEGG基因通路富集分析

将核心靶标导入KOBAS3.0数据库(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)中,应用KEGG功能进行通路分析。以p0.05q0.05,且从小到大排序作为筛选条件,选取符合条件的前20位的KEGG通路。

1.7 成分靶点通路网络构建

利用Cytoscape 3.7.2http://www.cytoscape.org/[11]中的关联:(Merge)功能,合并活性成分关键靶点通路网络图,在输出结果中,以不同颜色的节点(node)分别表示活性成分、靶点和通路。化合物和潜在靶点通过边缘(edge)相连,目标蛋白和通路也通过边缘相连。

1.8 主要成分与SARS-CoV-2ACE2分子对接

有研究显示,SARS-CoV-2SARS-CoV2种病毒感染均通过S蛋白与人体内血管紧张素转化酶IIACE2)结合来侵入机体[12-13]。利用分子对接软件分别对化合物与病毒S蛋白及ACE2的结合能力进行打分。在RCSB数据库(https://www.rcsb.org/)中下载SARS-CoV-2PDBID6LU7)和ACE2PDBID1R42)的立体结构,以.pdb格式进行保存。将大分子结构上的每个位点采用假原子形象表征出来用于对接计算,选择氨基酸数目最多的活性位点用于分子对接。接下来,对选取的靶蛋白进行准备,包括去除蛋白中的重复单元、加氢加电荷、选择力场和删除不必要的水分子等。然后对筛选出的20个最主要的活性成分配体进行能量最小化处理,确定蛋白的对接位点,选择基于配体受体结合能力的打分函数ASE进行评估,从而得到每个化合物与受体的对接打分值,打分值为负数说明有结合,对接打分值越小,配体与受体的结合越牢固。

2 结果

2.1 小柴胡汤化学成分搜集结果

小柴胡汤活性成分筛选共搜集到1 122种成分,其中柴胡288种、黄芩58种、半夏116种、人参190种、甘草280种、生姜64种、大枣126种。查阅文献发现,槲皮素(quercetin)、异鼠李素(isorhamnetin)、山柰酚(kaempferol)为甘草、柴胡的主要成分[14-15];黄芩素(baicalein)、汉黄芩素(wogonin)、5,7,2′,6′-四羟基二氢黄酮醇(5,7,2′,6′-tetrahydroxyflavone)为黄芩的主要成分[16]β-谷甾醇(beta-sitosterol)、松柏苷(coniferin)为半夏主要成分[17-18];人参皂苷(ginsenoside)、豆甾醇(stigmasterol)为人参的主要成分[19];儿茶素((−)-catechin)、小檗碱(berberine)、光千金藤碱(stepharine)为大枣主要成分[20-21]β-谷甾醇、6-甲基姜辣二醇双乙酸酯(6-methylgingediacetate2)为生姜主要成分[22-23]。再以OB30%DL0.18作为条件,对查询到的所有化学成分进行筛选,发现165种符合条件,作为候选化合物(表1)。

2.2 活性成分靶点搜集结果

将筛选出的有效成分名称输入Pubchem数据库,得到的化合物结构导入到PharmMapper预测靶点,去重后共得到168个活性成分靶点,再将得到的靶点名称输人UniProt数据库,转换成对应的基因名。

2.3 疾病靶点搜集结果

OMIM数据库、Genecards数据库中以“fever”(发热)作为关键字进行搜索,发现7 006个潜在作用靶点。将药物有效成分的靶点与疾病的靶点交叉,最终得到141个可能与小柴胡汤治疗发热作用相关的靶点(图1)。

2.4 核心靶点筛选及分子对接验证结果

String数据库构建的蛋白相互作用网络中包含141个靶蛋白节点,共有1515条相互作用连线,平均度值为21.6。其中度值较大的有MAPK3IL6VEGFATNFJUNMAPK1均与其他蛋白相互作用较强(图2)。分子对接结果显示,筛选出的核心靶点与关联度最大的20个活性成分结合度打分均为负数且数值较小,证明核心靶点和活性成分确有较好结合(表2)。

2.5 GO基因功能富集分析结果

将疾病和药物交集的关键靶点输人DAVID数据库,根据p0.05q0.05筛选出292GO条目。其中生物过程(biologicalprocessBP89个,占比30%;细胞组成(cellularcomponentCC81个,占比28%;分子功能(molecularfunctionMF122个,占比42%。得出小柴胡汤治疗发热的作用机制可能与G蛋白偶联受体、神经递质受体、类固醇激素受体、核受体等受体活性有关。同时有铵离子、血红素、神经递质、蛋白酶等多种物质参与。涉及到免疫、氧化还原、细胞代谢等分子功能。具体见图3

2.6 KEGG基因通路富集分析结果

将疾病和药物交集的关键靶点输人KOBAS 3.0数据库,共富集到30条通路。根据p0.05选取排名靠前的20条通路。分析显示靶点显著富集于神经活性配体受体相互作用通路、信号转导通路、MAPK通路、辅助性T细胞17信号通路、白细胞介素信号通路、钙离子信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、核受体信号通路等多个通路(表3)。

2.7 成分靶点通路网络构建

选取核心的30个基因,制作“成分靶点通路”的网络关系表,将其导入Cytoscape 3.7.2软件,构建出小柴胡汤治疗新冠肺炎发热的成分靶点通路网络图。如图所示,每个活性成分可作用于多个靶点(图4)。

2.8 活性成分与病毒及ACE2分子对接结果

选取关联度最大的20个活性成分,以及中国科学院上海药物研究所筛选出的10种可能对COVID-19有治疗作用的药物,包括阿比朵尔(Arbidol)、阿扎那韦(Atazanavir)、地瑞那韦(Darunavir)、茚地那韦(Indinavir)、卡非佐米(Kyprolis)、瑞德西韦(Remdesivir)、洛匹那韦(Lopinavir)、沙奎那韦(Saquinavir)、利托那韦(Ritonavir)、替拉那韦(Tipranavir)分别与ACE2SARS-CoV-23CL水解酶进行分子对接。ACE2的分子结合位点为ASN33HIS34GLU3SGLU37ASP38LYS353ALA386ALA387GLN388PR0389PHE390ARG393LYS390ASP392ASP393ARG395GLN396THR402GLY403VAL404TYR440ASN479ASP480TYR481GLY482TYR491SARS-CoV-23CL水解酶的结合位点为THR24THR25THR26LEU27HIS41CYS44THR45SER46MET49PRO52TYR54PHE140LEU141ASN142GLY143SER144CYS145HIS163HIS164MET165GLU166LEU167PRO168HIS172ASP187ARG188GLN189THR190GLN192。分子对接打分值见表4,相互作用和3D组合图见图56

3 讨论

COVID-19肆虐全国,来势汹汹,防控治疗刻不容缓。然而目前发现的几种药物,例如蛋白酶抑制剂茚地那韦、沙奎那韦、卡非佐米等,是否有确切的疗效尚未可知。吉利德公司的在研药物瑞德西韦被证明对SARS-CoV-2有一定的抑制作用,但未获得上市许可或批准,仍处于试验性阶段。阿比朵尔、达芦那韦2种药物的生物活性较差,也缺乏临床试验和研究数据。

中医药在COVID-19的治疗中发挥了十分重要的作用。从中医角度看,此次疫情发病急,病势重,传染性强,老少皆能致病。其病位既在肺,又在脾胃肠道。既属于疫毒犯肺之实证,亦有正气不足之虚象。因此在治疗上,祛邪的同时要兼顾扶正。从临床表现上看,患者初期大多表现为退而复发的往来寒热,又有口苦咽干、恶寒无汗、头身疼痛等症状,是典型的少阳病的表现。少阳经主司开关,中医称之为枢纽,邪气侵扰少阳,往往表现为正邪交争,分庭抗战,当正气尚能抗邪时,正邪交争而发热;当正气不足,邪进正退,则表现为恶寒。小柴胡汤有和解少阳、清热祛邪的功效,同时对疫病发热有很好疗效。许多医家曾用小柴胡汤治疗疫病。明代《济阴纲目》记载:小柴胡汤治瘟疫,内虚发热,胸胁痞满,及在半表半里,非汗非下之证。甚至一些史书中也有记载,《宋史五行志》:夏,行都又疫,高宗出柴胡制药,活者甚众。也有许多临床案例证明,小柴胡汤治疗外感发热效果很好,能够有效防止退热后复发的情况[24]。通过网络药理学成分筛选、靶点预测和网络分析,发现占据网络中心位置的丝裂原活化蛋白激酶3MAPK3)、白细胞介素6IL6)、血管内皮生长因子AVEGFA)、肿瘤坏死因子(TNF)、原癌基因c-JUN、丝裂原活化蛋白激酶1MAPK1)等在小柴胡汤的药理功能中起关键作用,可能是核心靶点。网络拓扑分析显示,小柴胡汤治疗COVID-19发热的过程中,涉及到多种生物过程、细胞组成和分子功能,是一个复杂的过程。同时,核心靶点显著富集于神经活性配体受体相互作用通路、信号转导通路、MAPK通路、辅助性T细胞17信号通路、白细胞介素信号通路、钙离子信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、核受体信号通路等多个通路。COVID-19的发热是感染性炎症所致的发热,MAPK是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者,它们调控着许多生理活动,如炎症、凋亡、癌化、肿瘤细胞的侵袭和转移[25]MAPK信号通路在炎症反应中发挥重要作用,原癌基因c-JUN的末端激酶(JNK)是MAPK信号通路的另一亚类。一些促炎性因子如TNF-α、白细胞介素家族(IL1IL6等)都可以激活JNK通路从而加剧炎症反应[26]VEGF通过炎症剌激、血管通透性增加、血管生成增多3个方面形成恶性循环,使炎症反应持续存在[27]。辅助性T细胞17Th17)可分泌IL-17IL-6TNF-α等多种效应因子,IL-17可通过诱导趋化因子和多种促炎细胞因子(如IL-6TNF-α)来介导炎症反应[28]。因此推测SARS-CoV-2可能是通过激活白细胞介素受体,启动MAPK途径,增加TNF-αIL-6IL-8等炎性因子的表达,发生局部炎性反应,引起发热。而小柴胡汤可能通过调节MAPK通路中的关键靶点,抑制炎性反应发生,从而起到治疗COVID-19发热的效果。这个推测有一定的科学性:周必发等[29]研究发现,与正常小鼠相比,H7N9禽流感病毒感染的肺损伤小鼠模型中TNF-αIL-1IL-6JNK水平显著升高,揭示了H7N9禽流感病毒感染小鼠的肺损伤部分由JNK/MAPK通路的激活所介导。谢璟等[30]研究发现,肺炎链球菌肺炎小鼠的肺间质有大量炎性细胞浸润,IL-1IL-6TNF-α水平较正常组增高,MAPKmRNA及蛋白表达均较正常组增高,提示MAPK信号通路活化参与调控肺炎链球菌肺炎小鼠肺组织的炎症反应。

冠状病毒侵入宿主细胞是其感染的前提。在SARS-CoV发生时期,科学家们发现,SARS-CoV主要依赖于病毒的S蛋白与受体细胞黏膜表面的ACE2结合[31]。石正丽团队研究发现,SARS-CoV-2进入细胞的受体也是ACE2,结合方式与SARS-CoV相同。ACE2是一种由805个氨基酸组成的I型跨膜蛋白,主要分布在肺脏、肾脏、睾丸、心脏等组织。就肺部而言,肺血管内皮细胞、支气管上皮细胞、肺泡细胞等都有表达[32]。冠状病毒通过S蛋白侵入宿主细胞的机制,以SARS-CoV为例,SARS-CoVS蛋白包括2个亚基S1S2[33]S1含有一个重要的受体结合域(RBD),正是这个位置与ACE2结合形成病毒体-ACE2复合物,然后将病毒体-ACE2复合物转运并通过融合肽进入靶细胞的内体。在融合肽插入到内涵体膜后,S蛋白中的(HR1HR2)结构域相互作用,形成六螺旋束(6Hb)核心,这将病毒包膜和细胞质膜紧密地融合在一起。病毒RNA基因组随后被释放到细胞质中[34-35]。随后,转录病毒RNA的负链,并通过翻译产生SARS-CoV的结构蛋白[36]。包装细胞质病毒RNA和结构蛋白以形成新病毒,并从感染的细胞中释放出病毒,以感染支气管和肺中的其他细胞。

通过分子对接,发现小柴胡汤的主要成分中β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)和3′-羟基-4′-O甲基葡糖苷(3′-hydroxy-4′-O-methylglabridin)与病毒和ACE2的结合度都很高。从以上3种成分与ACE2的相互作用图和3D空间构象可以看出,这3种成分与ACE2都有很强的结合力,从而抑制病毒S蛋白与ACE2结合。同时,3种成分与SARS-CoV-2的相互作用图和3D空间构象表明,其与病毒的结合能力也很强,亦有可能直接针对病毒发挥作用。

综上所述,COVID-19发病初期,属外邪犯肺入里化热,临床表现为往来寒热、口苦咽干、胸胁满闷、心烦喜呕的患者,可用小柴胡汤来和解少阳,清热祛邪。本研究采用网络药理学方法研究小柴胡汤活性成分治疗COVID-19发热的作用机制,经过查阅相关文献,验证了预测结果与其他实验研究的结果有较高的一致性,说明了这一方法的可行性,为后续研究提供了参考。中药复方的成分复杂,数据库不能收录所有的活性成分,且药物质量难以控制,网络药理学只是完成了初步的分析,具体的作用机制尚需要基础实验和临床试验进一步验证研究。

参考文献(略) 
来  源:杨  璐,崔换天,刘相国,温伟波,王洪武. 基于网络药理学的小柴胡汤治疗新型冠状病毒肺炎发热的可行性探讨 [J]. 中草药, 2020, 51(7):CNKI首发.
文献解读

文献解读:黑色素瘤免疫微环境结合DNA甲基化思路

2020-4-1 8:59:29

文献解读

中药单体小檗碱抗多发性骨髓瘤作用靶点的筛选及鉴定

2020-4-1 23:18:53

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