增强子是近期科研领域比较火的一个方向，CNS不断有牛文发表。今天，我们就肿瘤相关的增强子做一个整理，为研究提供方便。 1. 增强子所谓增强子（Enhancer），位于结构基因附近，是一类非编码DNA顺式作用元件，在真核生物的发育过程中通过结合转录因子、辅因子以及染色质复合物作用于启动子，可以激活或增强基因的转录。简单说：增强子是能够增加启动子活性从而增加基因转录频率的DNA序列。增强子通常具有以下特点：① 在转录起始点5’或3’侧均能起作用；② 相对于启动子的任一指向均能起作用；③ 发挥作用与受控基因的远近距离相对无关；④ 对异源性启动子也能发挥作用；⑤通常具有一些短的重复顺序。增强子分为以下两种类型：⑴ 细胞特异性增强子：能够在特定的细胞或特定的细胞发育阶段选择性调控基因转录表达的增强子称为细胞特异性增强子。例如，B细胞免疫球蛋白重链基因或轻链基因的增强子，只有在胚胎干细胞分化为B细胞时，才能对Ig基因起正调控作用。此外，α-类和β-类珠蛋白基因簇上游非编码区中均存在红细胞系特异性增强子。⑵ 诱导性增强子：在特定刺激因子的诱导下，才能发挥其增强基因转录活性的增强子称为诱导性增强子。如激素反应元件（HRE）及金属应答元件（MRE）2. 超级增强子除了增强子是调控细胞基因时空表达关键的顺式作用元件外，2013年，Richard A. Young 实验室基于当时增强子的研究，提出了超级增强子(Super-enhancers, SEs)概念[1]。超级增强子是具有转录活性增强子的一个大簇， 富集高密度的关键转录因子(Master transcription factors)、辅因子(Cofactor)和增强子表观修饰标记(Histone modification marks)(见图1)。在功能上超级增强子能够驱动控制细胞身份基因的表达，可以用来解释细胞类型特异的表达模式，在发育生物学、癌症等疾病致病机理研究中显示出巨大的应用潜力[1-4]。胚胎干细胞中的多个转录因子（Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、Esrrb、Nr5a2、Prdm14、Tcfcp2l1、Smad3、Stat3、Tcf3）富集在超级增强子上，在之前的研究中发现这些转录因子在胚胎干细胞中起着十分重要的作用。Richard A. Young曾激动地预言道：“‘超级增强子’具有广阔的研发前景和价值，必将成为下一个药物研发的黄金靶点！” 因此开展肿瘤相关超级增强子的研究，将有助深入解开肿瘤发病机制，并且可用于指导抗肿瘤药物的高效研发，具有重要的社会意义和经济价值。图1. 超级增强子及复合物结构示例图[1]超级增强子的鉴定目前对增强子鉴定，主要采用染色质免疫共沉淀技术（ChIP-seq） 针对活性增强子相关联的因子或组蛋白修饰进行检测，如转录因子、转录辅激活因子(如Mediator、p300)、组蛋白修饰H3K27ac 和H3K4me1等。活性增强子通常同时含有H3K27ac 和H3K4me1 修饰，而静态增强子(poised enhancer)一般同时具有H3K4me1 和H3K27me3 组蛋白标记[4-6]。在此基础上，超级增强子依据增强子转录活性标记分子结合水平强度的差异进行鉴定。在分析方法上，首先对所得增强子进行缝合。主要依据在基因组范围内，这些单个增强子实体间如在12.5 kb 范围内，则合并为单个实体，即缝合增强子(Stitched enhancer)。最后，确定超级增强子和普通增强子之间的阈值。缝合增强子和其余的单个增强子按照ChIP-seq所测信号水平的强度排序，绘制获得一张曲线图，该曲线上斜率为1 的切线的切点所得的信号值为区分超强增强子和普通增强子之间的阈值，高于该值为超级增强子，其余的则称为普通增强子(Typical enhancer)[1,2]（见图2，图3）图2. 确定超级增强子和普通增强子之间的阈值[1]图3.普通增强子与超级增强子示例图[3]总结下来，识别增强子有以下几种方法：(1)Chip-seq/Chip-chip识别转录因子结合位点，(2) 增强子特异的因子也可用于识别增强子，如EP300，EP300 的结合位点常用于预测增强子；(3)RNA 聚合酶 Ⅱ 能与数千个增强子结合，所以 RNA 聚合酶 Ⅱ 的最大亚基POLR2A 也可用于寻找增强子位点；(4)脱氧核糖核酸酶 Ⅰ 超敏位点 (DHS) 代表开放染色质区域，许多覆盖有增强子；(5)甲醛辅助分离调控元件 (FAIRE) 结合测序，能识别大量激活调控元件，包括增强子；(6) 一些组蛋白修饰模式反应了不同的染色质状态，如H3K4me1 和 H3K27ac 的结合广泛用于增强子的标记；(7) 增强子序列能够转录，转录的增强子RNA(eRNA) 也是激活增强子的标志；(8)染色体 3D 构象的方法 (e.g. 5C and ChIA-PET, Capture-C) 也能提供增强子 – 启动子相互作用的信息。鉴定出超级增强子之后，可以根据基因位置预测超级增强子所调控的编码蛋白基因和非编码RNA的表达，通过结合转录组测序技术，可以对超级增强子和肿瘤异常高表达的mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA进行关联分析，从而推断关键的超级增强子，进一步锁定肿瘤相关的基因，有利于指导下一步的抗肿瘤功能研究。癌症细胞可以通过突变、关键正常基因超级增强子的染色体易位、局部扩增、过度表达致癌转录因子等遗传机制来构建驱动致癌基因的超级增强子[3,7,8]。目前研究表明常见的复杂疾病和超级增强子之间也是相关联的。Richard A. Young 实验室对GWAS 鉴定的5 303 个疾病特征相关SNP 分布分析表明，大部分SNP 仅生在非编码区域(93%)，其中64%的位点富集于增强子区域，并且富集于超级增强子的变异要显著多于普通增强子[3]（见图4）。因此锁定目标超级增强子区域后，可以结合大样本的靶向捕获测序，对目标增强子区域进行DNA测序，有助于快速发现肿瘤相关的突变位点，获得新的诊断标志物。图4. 超级增强子区域存在大量疾病相关的突变位点[3]研究增强子必备数据库上述提到的识别增强子的方法能够获得增强子位点，但增强子位点信息分散与多个数据库，亟待整合。而且，不同技术得到的增强子位点有较大差异，所以在不同技术中都能找到的增强子位点才更加可靠。以下为大家提供几个常见的研究增强子的数据库。1、EnhancerAtlas ：一个整合的增强子数据库。http://www.enhanceratlas.org/index.php2、dbSUPER：超级增强子数据库。它不仅列出了与超级增强子相关的基因，还链接到外部数据库，如GeneCards，UniProt和Entrez。https://omictools.com/dbsuper-tool3、SEdb: 一个“超级”全面的人类超级增强子数据库。 http://www.licpathway.net/sedb/4、VISTA Enhancer Brower：增强子实验验证数据集。https://enhancer.lbl.gov/超级增强子研究思路超级增强子的研究涉及ChIP-seq、生物信息分析、后期功能研究等关键技术，存在一定的难度。基于超级增强子的抗癌策略及药物开发根据超级增强子结构特点及形成的功能性复合物，只要干扰其中关键组成成分，即可以影响超级增强子的功能发挥，进而影响下游调控基因的表达水平，从而起到治疗作用。2013年4月，超级增强子研究的开拓者Young与哈佛大学医学院研究员James Bradner合作成立了锡罗斯生物制药公司（Syros Pharmaceuticals Inc.）。Syros充分利用自主知识产权的基因研究平台，筛查病变组织中异常激活的DNA非编码片段。Simonian希望公司能够找到新型致病基因，并开发一类能够特异性靶向DNA非编码调节性区段，研发能够直接靶向特定靶点的小分子药物。Syros专注开发那些能够靶向于转录因子，转录性激酶和其他转录调节活性蛋白的新型基因调控药物。（见图5）图5. Syros基于超级增强子的新药研发策略（来源于Syros官网）目前，Syros的首席药物候选物SY-1425已经进入二期临床试验，这是一种选择性RARa激动剂，用于治疗基因定义的急性骨髓性白血病亚型患者和骨髓增生异常综合征患者。另一产品SY-1365是具有一定潜能的选择性CDK7抑制剂，适用于实体瘤和血液癌症。（见图6）图6. Syros新药研发管线进展（来源于Syros官网）总结：超级增强子关联控制细胞身份的关键基因，许多肿瘤细胞关键致癌基因的表达由超级增强子所驱动，常见疾病相关的变异显著富集于超级增强子，这些功能特征可以用以鉴定细胞类型特异的关键转录因子，寻找关键的致癌基因，发现疾病关联变异位点，显示了巨大的应用潜力。随着研究的深入, 超级增强子或将会为肿瘤、自身免疫学疾病、糖尿病等复杂疾病治疗技术的开发提供新的思路。参考文献[1] Whyte WA, Orlando DA, Hnisz D, Abraham BJ, Lin CY, Kagey MH, Rahl PB, Lee TI, Young RA. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell, 2013, 153(2): 307–319.[2] Lovén J, Hoke HA, Lin CY, Lau A, Orlando DA, Vakoc CR, Bradner JE, Lee TI, Young RA. Selective inhibition of tumor oncogenes by disruption of super-enhancers. Cell, 2013, 153(2): 320–334.[3] Hnisz D, Abraham BJ, Lee TI, Lau A, Saint-André V, Sigova AA, Hoke HA, Young RA. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell, 2013, 155(4): 934–947.[4] Creyghton MP, Cheng AW, Welstead GG, Kooistra T,Carey BW, Steine EJ, Hanna J, Lodato MA, Frampton GM,Sharp PA, Boyer LA, Young RA, Jaenisch R. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci USA, 2010,107(50): 21931–21936.[5] Heintzman ND, Hon GC, Hawkins RD, Kheradpour P,Stark A, Harp LF, Ye Z, Lee LK, Stuart RK, Ching CW, Ching KA, Antosiewicz-Bourget JE, Liu H, Zhang XM,Green RD, Lobanenkov VV, Stewart R, Thomson JA,Crawford GE, Kellis M, Ren B. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature, 2009, 459(7243): 108–112.[6] Rada-Iglesias A, Bajpai R, Swigut T, Brugmann SA, Flynn RA, Wysocka J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature, 2011,470(7333): 279–283.[7] Mansour MR, Abraham BJ, Anders L, Berezovskaya A,Gutierrez A, Durbin AD, Etchin J, Lawton L, Sallan SE,Silverman LB, Loh ML, Hunger SP, Sanda T, Young RA,Look AT. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science, 2014, 346(6215):1373–1377.[8] Gröschel S, Sanders MA, Hoogenboezem R, de Wit E,Bouwman BA, Erpelinck C, van der Velden VHJ, Havermans M, Avellino R, van Lom K, Rombouts EJ, van DuinM, Döhner K, Beverloo HB, Bradner JE, Döhner H, Löwenberg B, Valk PJM, Bindels EMJ, de Laat W, Delwel R.A single oncogenic enhancer rearrangement causes concomitant EVI1 and GATA2 deregulation in leukemia. Cell, 2014, 157(2): 369–381.[9] Suzuki H I, Young R A, Sharp P A. Super-Enhancer-Mediated RNA Processing Revealed by Integrative MicroRNA Network Analysis[J]. Cell, 2017, 168(6): 1000-1014. e15.参考资料[1] http://www.epibiotek.com/xinwenzixun/151.html[2] http://blog.sina.com.cn/s/blog_4b07ffbc010172rb.html[3] https://mp.weixin.qq.com/s/GM6Q93Ryxs-zmhg4bIa3sg[4] 孙长斌, 张曦. 超级增强子研究进展[J]. 遗传, 2016, 38(12):1056-1068.[5] 周洋, 施晓敏, 韩澍,等. 超级增强子的发现与研究进展[J]. 国际生殖健康/计划生育杂志,2017,36(2):137-141.[6] http://www.cn-healthcare.com/articlewm/20160706/content-1004190.html[7] http://www.sohu.com/a/139708313_282570[8] http://www.epibiotek.com/xinwenzixun/151.html
