相分离与早期自噬小体形成

细胞自噬(Autophagy)是真核生物对细胞内物质进行降解的重要过程。细胞自噬将蛋白或细胞器等物质通过双层膜结构的自噬小泡包裹后,送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。与蛋白酶体 (Proteasome) 降解途径相比, 溶酶体具有更强大的降解能力, 因此细胞自噬可以大批量的降解从可溶蛋白到完整细胞器在内的胞内物质。细胞自噬已经被证明在生物体生长发育、免疫防御、细胞程序性死亡、肿瘤抑制、神经性病变抑制等方面有非常重要的作用【1】
自比利时科学家Christian de Duve在上世纪50年代发现,并命名溶酶体以来,自噬的神秘面纱逐渐被揭示。二十世纪九十年代初,以Yoshinori Ohsumi 为代表的一批细胞生物学家以酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 为模式生物展开了相关细胞自噬基因的筛选和细胞生物学的研究,取得了一系列的重要进展。到目前为止酵母中已经有多种细胞自噬相关基因 (Atg, Autophagy-relaetd Genes) 被发现。经过近三十年的积累, 酵母已成为细胞自噬分子机制研究中最为充分的模式生物。
细胞自噬过程中,有几个重要的ubiquitin-like conjugation system,对于细胞自噬发生起着关键的作用【2,3】。其中Atg1 kinase complex(包括:Atg1, Atg13, Atg17, Atg29和Atg31)对于早期的PAS(pre-autophagosomal structure,PAS)结构的形成以及后续的autophagosome的形成起着至关重要的作用。Atg1 complex 中的蛋白都包含有大量的IDR(内在无序序列)区域,且Atg1 complex 在细胞内的表现,可能是一种相分离的结构。
近日,来自日本的Yoshinori Ohsumi & Nobuo N. Noda课题组在Nature杂志上发表了题为Phase separation organizes the site of autophagosome formation的文章,阐明了PAS结构的物理化学本质。PAS事实上就是Atg 蛋白聚集在一起通过相分离形成的“液滴”状结构。另外,作者通过一系列的实验,阐明了该过程的精细的细胞内的调控机制。
作者首先建立了过表达GFP-Atg13的酵母细胞,当使用nitrogen starvation处理该种酵母细胞时候,作者发现,GFP-Atg13会形成Puncta,当重新补充nitroge sources后,这种Puncta结构迅速消失,提示了这种Puncta结构是一种高度动态的结构,可以迅速形成,也可以迅速消失。作者进一步对于这种结构进行深入探索,FRAP以及FCS实验证实,这种结构自身内部的组分处于高度动态的过程,同时与外部环境中的GFP-Atg13也处于高度的物质交换过程中,另外,作者发现,这种结构,两两之间能够相互融合,融合后迅速恢复圆形的结构,当加1,6-己二醇处理细胞后,这种结构迅速消失,当撤掉后,这种结构又重新形成。这些实验结果表明,由GFP-Atg13等形成的Puncta结构是一种由液-液相分离所形成的“液滴”结构。
 
那么是否可以通过Atg1 complex 的组成蛋白在体外重塑这个液-液相分离过程?这个问题的研究将进一步阐明由Atg1 complex介导的PAS结构形成的物理化学本质。作者纯化了Atg1, Atg13以及Atg17-Atg29-Atg31蛋白,并分别将这些蛋白用不同的荧光标记。体外的实验证实,Atg1, Atg13以及Atg17-Atg29-Atg31混合在一起后确实能够很好的发生相分离,形成液滴状结构,并且这些蛋白处于同一个液滴中。另外,有趣的是,作者发现,这种相分离现象在pH 6.0的时候最高效,当pH 大于7.0以后,这种现象将明显减弱,这与酵母细胞内的环境一致(酵母在饥饿环境下细胞内pH将降低到6.0左右),说明了体外的实验很好地模拟了体内的环境,这种相分离的形成收到pH变化的精细调控。另外,作者通过之前的研究积累,以及实验证实,在Atg1 complex发生相分离的过程中Atg13以及Atg17-Atg29-Atg31是作为相分离的Scaffold,而Atg1作为client。
 
在证实了确实能够发生相分离后,作者将研究的重点转移到了这种相分离是如何被细胞精细调控的机制研究上。在正常的细胞环境中,Atg13被TORC1高度磷酸化,这种高度磷酸化状态的Atg13抑制了Atg1 complex 的形成。Autophagy发生的过程中,Atg13的磷酸化会减弱,从而调控了autophagy的发生。之前已经有研究表明,TORC1可以通过磷酸化调节PGL-1/PGL-3相变的能力,由此产生的液滴由于其物理特性及组成的不同,而不易被自噬作用选择性降解【4】。 那么是否这种磷酸化的变化,能够直接调控前面研究的相分离过程?
 
作者首先利用纯化的TORC1蛋白将Atg13在体外磷酸化,作者发现,这种磷酸化后的Atg13不再能够与Atg17-Atg29-Atg31发生相分离。说明了Atg13的磷酸化能够显著抑制这种相分离的发生。之前的研究表明,Atg1会在饥饿条件下被激活,并发生自磷酸化。作者发现,Atg13与Atg17-Atg29-Atg31发生相分离后能够显著促进client  Atg1蛋白的活性显著升高,同时作者发现,Atg1活性增强后,会发生自磷酸化,并且磷酸化Atg13, Atg29,同时发现,这种磷酸化事件会显著减弱Atg1 complex的相分离,这一结果与体内的结果不相符,在细胞内即使Atg1激活后,PAS结构仍然能够存在几个小时,但是在体外实验中,Atg1激活后,几分钟的时间内,Atg1 complex 的相分离就会被显著抑制,这一结果提示了在体内还有更精细的调控机制。进一步的研究发现,磷酸酶Ptc2能够去磷酸化Atg1 complex 并且促进相分离的发生。因此,作者通过系列实验,证实了Atg1 complex的相分离受到磷酸化与去磷酸化的精细调控。
在体内autophagy 发生的时候PAS结构的形成发生在酵母细胞的vacuolar膜上,Vac8蛋白对于PAS结构锚定到Vacuolar膜上起着非常重要的作用。作者尝试在体外重塑这一结构,作者在体外使用giant unilamellar vesicles模拟细胞内的Vacuolar结构,并在膜上锚定Vac8蛋白。作者发现,Atg1 complex通过相分离形成的PAS结构能够非常好的定位到锚定了Vac8的giant unilamellar vesicle上,但是不能定位到没有锚定Vac8的giant unilamellar vesicle上。进一步的研究发现,定位到giant unilamellar vesicle的PAS结构,能够两两之间相互融合,逐渐形成大的液滴状结构。
因此,作者通过一些列实验,在体外重塑了早期的PAS结构,并证实该过程由Atg1 complex通过相分离形成,而且该过程受到细胞内pH以及磷酸化与去磷酸化的精细调控。作者证明了Atg1 complex通过相分离形成的早期PAS结构,再与Vac8等蛋白的作用,定位到Vacuolar结构上,揭示了autophagy发生早期的事件的物理化学本质。
对于相分离在autophagy中的作用,已经有一些报道,之前的报道集中于阐述autophagy的底物发生相分离然后通过autophagy降解,详细可以参考张宏课题组的综述文章(Phase Separation, Transition, and Autophagic Degradation of Proteins in Development and Pathogenesis)【5】。比如:张宏组揭示mTOR调控相变以及自噬性降解的机制【4】;清华大学李丕龙与俞立课题组合作证实,p62识别目的蛋白上的多聚泛素化链,通过相分离的机制形成p62小体,进而介导自噬小体的形成6】。另外,一月份Molecular Cell 杂志online了Yoshinori Ohsumi & Nobuo N. Noda课题组的文章,Liquidity Is a Critical Determinant for Selective Autophagy of Protein Condensates以Ape1的相分离,Atg19作为receptor介导其与Atg8-PE 的结合,从而诱导selective autophagy的发生为代表,证实了相分离对于selective autophagy的调控作用【7】。随着研究的深入,详细相分离在autophagy领域还有更多的文章发表,对其详细的机制会有更深入的阐述。
另外,这篇Nature文章 Received 17 December 2018;Accepted 02 December 2019;前后经历了一年的时间,在2018年的会议上Yoshinori Ohsumi就讲述了文章的内容。与当时报告相比,文章中多了很对相分离调控机制的数据,可见相分离的研究已经越来越深入,开始转向其调控机制的深入研究。
 
原文链接:https://doi.org/10.1038/s41586-020-1977-6
1. B. Levine, G. Kroemer, Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell 132, 27-42 (2008).
2. J.-C. Farré, S. Subramani, Mechanistic insights into selective autophagy pathways: lessons from yeast. Nature reviews. Molecular cell biology 17, 537-552 (2016).
3. V. Rogov, V. Dötsch, T. Johansen, V. Kirkin, Interactions between autophagy receptors and ubiquitin-like proteins form the molecular basis for selective autophagy. Molecular cell 53, 167-178 (2014).
4. G. Zhang, Z. Wang, Z. Du, H. Zhang, mTOR Regulates Phase Separation of PGL Granules to Modulate Their Autophagic Degradation. Cell 174, 1492-1506.e1422 (2018).
5. Z. Wang, H. Zhang, Phase Separation, Transition, and Autophagic Degradation of Proteins in Development and Pathogenesis. Trends Cell Biol 29, 417-427 (2019).
6. D. Sun, R. Wu, J. Zheng, P. Li, L. Yu, Polyubiquitin chain-induced p62 phase separation drives autophagic cargo segregation. Cell Res 28, 405-415 (2018).
7. A. Yamasaki et al., Liquidity Is a Critical Determinant for Selective Autophagy of Protein Condensates. Molecular cell, S1097-2765(1019)30956-30956 (2020).
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