基于干预细胞因子风暴文献挖掘的中医药治疗重症新型冠状病毒肺炎探讨

  要:新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019COVID-19)临床以发热、乏力、干咳为主要表现,少部分患者可因“细胞因子风暴”在中低热甚至无明显发热病程中快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒性休克、代谢性酸中毒和凝血功能障碍,甚至多器官衰竭而导致重症患者死亡。尸检发现COVID-192003年的严重急性呼吸综合征(SARS)和2015年国内的中东呼吸综合征(MERS)有相似之处。从中医药干预细胞因子风暴治疗SARS重症文献分析入手,运用数据挖掘和网络药理学方法,探讨中医药治疗重症COVID-19与干预细胞因子风暴密切相关的作用路径和潜在的机制靶点,以期为临床针对“细胞因子风暴”这一关键病理过程,进行精准的组方潜药、科学的联合用药、靶向的筛选新药提供参考,有效地遏制COVID-19患者细胞因子风暴的发生和发展,促进其良好的临床转归。

冠状病毒是引起许多家畜、宠物、人类感冒等疾病的重要病原,还是2003年严重急性呼吸综合征severeacute respiratory syndromeSARS2012中东呼吸综合征(middle east respiratory syndromeMERS的病原体2019新型冠状病毒是在人体中发现的一种新的冠状病毒毒株,被国际病毒分类委员会命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2SARS-CoV-2),其所致疾病COVID-19coronavirusdisease 2019主要临床表现为发热、咳嗽、气促和呼吸困难等目前尚无特异治疗方法目前国家卫生健康委员会公布湖北省在治重症病例数占在治病例总数比例为22.21%湖北省外为10.08%病毒感染可引发细胞因子风暴cytokine storm),进而导致严重的急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征甚至多器官功能衰竭直至死亡。临床应用大剂量的糖皮质激素治疗是唯一有效的治疗选择,但后遗的骨股头坏死、肺纤维化、抑郁症等不良反应将伴随终生,不仅严重影响患者的身心健康和生活质量,而且给患者、家庭、社会造成了巨大的经济负担。因此,寻找因细胞因子风暴导致的重症COVID-19治疗药物,不仅是目前缓解疫情之需,也是对其他细胞因子风暴所致重症感染或免疫系统紊乱疾病的临床需求。本文从中医药干预细胞因子风暴治疗SARS和流感重症文献分析入手,运用数据挖掘和网络药理学方法获知其干预细胞因子风暴密切相关的作用路径和潜在靶点,根据国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》针对重型疫毒闭肺证中推荐使用的中药复方进行进一步的文献分析比对,构建现有治疗重症COVID-19复方中高频次关键药味与干预细胞因子风暴密切相关的作用路径和潜在靶点,以期为临床针对“细胞因子风暴”这一关键病理过程,加强中西医结合,提高中医药治疗重症COVID-19患者的参与度提供有益的参考。

1  重症COVID-19与细胞因子风暴

1.1  细胞因子风暴的病理特点和损伤机制

细胞因子风暴是20世纪90年代初期提出的一种描述机体对器官移植排斥而产生大量炎症爆发的病理状态[1],又称炎症因子风暴和高细胞介质症(hypercytokinemia),是一种细胞因子与免疫细胞间的正反馈循环而产生的免疫反应,是机体的免疫系统从“自我保护”演变为“过度保护”的状态[2]

病毒等病原体感染机体后,会释放病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patternsPAMPs,包括病原微生物自身的核酸、蛋白质及代谢中间产物)到细胞内,被宿主细胞的宿主模式识别受体(pattern recognition receptorPRR)识别,通过调控不同的分子信号通路诱导I型干扰素、促炎症因子及多种抗病毒基因的表达[3]。目前,已报道较为公认的PRR有定位于细胞膜结构上的Toll样受体家族(Toll like receptorsTLRs)、定位于细胞质中的NOD样受体家族(nucleotidebinding oligomerization domain-like receptorsNLRs)、RIG-I样受体家族 [retinoid acid-induciblegene-I (RIG-I)- like receptorsRLRs] DNA识别受体等[4]。作为最早被发现的PRR,不同的TLR可识别不同的PAMPsTLR7TLR8主要识别病毒的ssRNA,通过活化髓样分化蛋白抗原(MyD88)招募并促进白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK)自身磷酸化,随后激活E3泛素连接酶TRAF6并通过上调TAK1/ IKK/IκB/NF-κB通路及TAK1/p38/JNK/ERK1/2通路诱导炎症反应[5]RLR家族主要包括RIG-IMDA5LGP2,其中RIG-I主要识别ssRNAdsRNAMDA5主要识别长片段dsRNA。病毒入侵后,RIG-I通过其CTD结构域识别病毒RNA,暴露结构域并促进CARD发生寡聚化激活RIG-I,最终激活的RIG-I通过招募VISA激活IKK/IκB/NF-κB通路及TAK1/IKK/IRF3/IRF7/NF-κB通路诱导炎症反应[6]。激活组织器官内的免疫细胞并使其大量分泌多种细胞因子和趋化因子,包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorTNF,如TNF-α)、白细胞介素(interleukinIL,如IL-1IL-6IL-12)、干扰素(interferonIFN,如IFN-αIFN-βIFN-γ)、单核细胞趋化因子-1MCP-1)等,导致炎症因子风暴的启动。其中最重要的细胞因子为IFNTNF-αIL-6IIFN中包括IFN-αIFN-β,主要由巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞产生,II型干扰素IFN-γ主要由NK细胞、CD4+CD8+T细胞以及Th1细胞产生,可一同促进免疫应答,TNF-αIL-6则可以通过信号传导,促进免疫细胞向原发感染部位转移[7]。这些暴增的细胞因子和趋化因子随后募集吸引白细胞和淋巴细胞到病灶部位,淋巴细胞和巨噬细胞持续激活和扩增,试图通过释放炎症介质消灭病毒[8]。然而,炎症因子的压倒性释放不仅会招募更多免疫细胞,同时也损伤了自身的免疫系统稳态和正常细胞的功能。

1.2  冠状病毒感染后的细胞因子风暴的临床特点

冠状病毒感染机体后,可以经过上述过程启动细胞因子风暴,大量免疫细胞和组织液聚集肺部,改变血管壁的通透性,阻塞空气进出并引起肺部炎症和水肿,病人会出现呼吸极度困难,血氧饱和度下降,意识不清等危险症状,进一步导致多器官衰竭甚至死亡[9]。不同的病毒所引发的细胞因子大量分泌的情况不尽相同,SARS感染后高表达和过度分泌的细胞因子依次为IL-1βIL-6IL-12IFN-γIP10CXCL10)以及MCP-1等,MERS感染后依次为IFN-γTNF-αIL-15IL-17相关[10-12]。有学者对COVID-19重症监护(ICU)患者检测发现IL-2IL-7IL-10G-SCFIP10MCP-1MIP-1A以及TNF-α[13]水平明显高于非重症患者。这既与病毒感染的治疗方式、致病机制不同有关,也与个体临床表现差异和实验室检查有关,但无论如何,可以通过规范研究尽快在这些因子中寻找相关标志物,并用于干预治疗和评价疗效、预测转归。

1.3  COVID-19与细胞因子风暴的发病特点与临床救治

SARS-CoV-2基因组为单正链RNA,研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85%以上[14]。一部分患者早期发病隐匿,甚至没有发热症状,在10 d左右病情加速并急转直下,很快进入多器官衰竭状态,与细胞因子风暴非常相似[15]。血管紧张素转化酶2angiotensin-convertingenzyme 2ACE2)作为一种羧肽酶,和ACE1一起调控血管紧张素的转换过程。同源性建模的结果显示,SARS-CoV-2SARS-CoV具有相似的受体结构域结构[16]。石正丽团队认为ACE2SARS-CoV-2的主要功能性受体,病毒通过包膜上S蛋白与ACE2受体结合入侵肺部细胞[17],下调肺内ACE2水平并促使肺内ACE2ACE失衡,升高的血管紧张素IIAng II)导致肺部毛细血管通透性增加,出现肺水肿及炎症因子浸润;炎症因子风暴产生的瀑布样级联反应会迅速造成肺水肿和呼吸困难,甚至死亡,见图1

据《柳叶刀》论文报道,在早期的99个病例中,17COVID-19患者出现了急性呼吸窘迫综合征(acute respiratorydistress syndromeARDS),病情短期内出现恶化,伴随呼吸衰竭并最终多器官衰竭致死,共有11例死亡[18];这是由细胞因子风暴造成的肺毛细血管内皮细胞以及肺泡上皮细胞的弥漫性损伤而导致ARDS的发生[19],临床发现大量升高的细胞因子主要为IL-6TNF-αIFN-γ[20]。目前临床对此尚无特异性治疗,主要是给予糖皮质激素以非特异性地抑制ARDS伴随的炎症反应,但长期使用副作用明显,且易引起二重感染。《柳叶刀》最新发表的一项临床研究就明确指出,基于以往治疗SARS等感染的临床数据分析,并不支持糖皮质激素治疗SARS-CoV-2感染造成的肺损伤[21]

2  中医药对重症COVID-19和细胞因子风暴的认识

2.1  中医药对重症COVID-19的认识

日前国家修订的《新型冠状病毒诊疗方案(试行第六版)》中对中医药治疗重症COVID-19和中西医结合治疗重症COVID-19有了更清晰明确的阐述[22]。诊疗方案表明,COVID-19属于中医“疫病”范畴,病因为感受“疫戾”之气,是疫疠之邪夹湿伤肺而及于全身。清代医家吴贞所著《伤寒指掌》中记载:“大疫发时,或挟寒,或挟暑,所谓兼六淫也”,COVID-19是以非时疫气所犯,兼有热、燥、寒、湿、瘀等邪,侵犯人体后往往迅速充斥表里、内外,弥漫三焦,若不及时施治,可造成多脏腑的广泛损害[23]。叶天士有“大凡看法,卫之后方言气,营之后方言血”之说,但由卫直接传入营血,病情多为危重[24]。正确把握病位病情,科学掌控转归趋势,积极主动辨证施治,是中医药治疗COVID-19重症患者的理论和实践基础,对防止病情急速加重或助其驱邪好转有重要意义。

《新型冠状病毒诊疗方案(试行第六版)》将重症COVID-19分为2种证型:(1)疫毒闭肺证,推荐处方为生麻黄、杏仁、生石膏、甘草、藿香、厚朴、苍术、草果、法半夏、茯苓、生大黄、生黄芪、葶苈子、赤芍。(2)气营两燔证,推荐处方为生石膏、知母、生地、水牛角、赤芍、玄参、连翘、丹皮、黄连、竹叶、葶苈子、生甘草。现有数据发现,上述方剂对其相应证型患者有较好疗效。且指南中还推荐了喜炎平注射液,血必净注射液,热毒宁注射液等中成药作为治疗药物。

2.2  中医药干预细胞因子风暴的文献挖掘

现有研究表明,中药在抑制细胞因子风暴方面有一定的优势。喜炎平注射液有较好的抑制炎症、调节机体免疫功能的作用,可有效对抗病原体引起的脓毒血症。陈伟等[25]对喜炎平注射液主要成分穿心莲内酯总酯磺化物进行研究证实,其可明显对抗严重的脓毒血症,并可在早期明显降低IL-6等炎性因子浓度、减少中性粒细胞的数量。

血必净注射液中主要成分有红花、赤芍、川芎、丹参、当归,通常与抗生素联用治疗脓毒症并可改善预后,大量研究表明血必净注射液联合西医治疗比单纯西医治疗对重症肺炎患者的恢复以及预后有更好的效果,并可以减轻患者的后遗症,提高生活质量[26]。研究发现血必净注射液通过抑制IL-6IL-1TNF-α等促炎细胞因子而发挥明显的抗炎作用,并通过影响机体免疫细胞的数量来调节免疫功能,可有效预防内源性炎性介质引发的多器官功能衰减或减轻其发病后的严重程度,也可有效保护患者的肺脏功能和组织结构,以减轻肺损伤;另该药还可以纠正机体的“过度免疫”,有利于控制疾病向“细胞因子风暴”发展,改善脏器功能,重建免疫平衡的效果,降低轻症转为重症患者的几率,降低患者的病死率[27-28]

以青蒿、金银花、栀子为主要成分的热毒宁注射液的作用是解热、抗炎、抗病毒,并且有研究表明可通过抑制IL-6IL10等细胞因子来干预细胞因子风暴[29],而且其还能发挥对脂多糖(LPS)导致大鼠急性肺损伤(acute lung injuryALI)的保护效应。

羌跖汤(羌活、大青叶、鸭跖草、板蓝根)对甲型流感病毒感染小鼠模型有通过抑制细胞间黏附因子-1ICAM-1)来抑制细胞因子风暴的作用,并且预防给药可以对小鼠起到更强的保护作用[30]。中药成分也对细胞因子风暴有一定作用,如姜黄素可抑制关键促炎细胞因子IL-1IL-6TNF-α的释放,并改善细胞因子风暴导致的某些临床症状,给临床诊断为细胞因子风暴的患者iv姜黄素可将血中增高的细胞因子降到正常水平[31]

3  借鉴中医药治疗SARS经验挖掘并预测中医药干预细胞因子风暴治疗重症COVID-19的作用路径和潜在靶点

3.1  干预细胞因子风暴治疗SARS和重症流感中医药应用进展

SARS和重症流感中药治疗方案进行文献挖掘,参考细胞因子爆发病理过程,以《传染性非典型肺炎(SARS)中医诊疗指南》[32]和《流行性感冒诊疗方案(2019年版)》为依据,选择与细胞因子风暴表现基本相符的SARS进展期的疫毒壅肺证和重症流感的毒热壅肺证的中药治疗方案进行文献挖掘和分析。

SARS指南中,进展期疫毒壅肺证所用中药为生石膏(先煎)、知母、炙麻黄、银花、炒杏仁、生苡仁、浙贝母、太子参、生甘草。流感方案中重症毒热壅肺证所用中药为炙麻黄、生石膏(先煎)、杏仁、知母、鱼腥草、葶苈子、黄芩、浙贝母、生大黄(后下)、青蒿、赤芍、生甘草。综合2个方子可以发现,生石膏、炙麻黄、杏仁、生甘草、浙贝母、知母为两方共有药味;进一步文献挖掘发现,麻黄、甘草药对可有效降低小鼠肺组织和肺泡灌洗液中的Th2型细胞因子(IL-4IL-5IL-13)的分泌[33]。在LPS诱导的RAW264.7细胞的体外抗炎实验中,可以抑制M1型相关基因IL-1βIL-6及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达,抑制巨噬细胞向M1方向的分化,抑制TNF-α等炎症因子及NO的分泌[34]。石膏水煎液可降低LPS诱导的全身炎症反应综合征模型小鼠血清中TNF-αIL-6的含量,以及小鼠肺组织中IL-1βTNF-αIL-6的含量[35]。苦杏仁水煎液可以降低佐剂性关节炎大鼠血清中TNF-αsICAM-1的水平,减轻组织炎症发展[36]。在LPS诱导A549/THP-1细胞共培养炎症模型中,浙贝母中的贝母素甲和贝母素乙及其有效部位,在不同浓度下可以降低模型细胞中IL-1βIL-6IL-23、基质金属蛋白酶(MMP-9)等细胞因子水平[37]。知母中主要成分知母皂苷可显著降低LPS诱导的星形胶质细胞(astrocyteAC)内TNF-α的水平[38]。综上,生石膏、炙麻黄、杏仁、生甘草、浙贝母、知母这6味中药具有调控细胞因子的作用,对SARS和重症流感中发生的细胞因子风暴有明显的干预作用。

3.2  历版指南交集药味干预细胞因子风暴治疗重症COVID-19潜在作用机制预测

历版指南中重症COVID-19的推荐中药处方见表1。综合各版诊疗方案中的用药频次(图2),发现麻黄、杏仁、石膏为使用频次最多药味(用药频次为4次),故运用网络药理学手段,对这3味药干预细胞因子风暴治疗重症COVID-19潜在作用机制进行预测,因石膏属于矿物药,暂时无法对其进行分析,选择用药频次3次且与石膏同属于清热药的大黄进行分析。基于TCMSPhttp://tcmspw.com/ tcmsp.php)、CTDhttp://ctdbase.org/)、UniProthttps://www.uniprot.org/)、Swiss Target Predictionhttp://www.swisstargetprediction.ch/)、PubMedhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)等多个数据库,通过Cytoscape 3.7.2软件,分别构建麻黄、杏仁、大黄与细胞因子风暴的关联网络,并用FunRich软件对最终靶点进行基因本体论(gene ontologyGO)分析和通路(pathway)分析,其中GO分析主要包括细胞组成(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物过程(biological process3个方面。

3.2.1  麻黄 结果显示麻黄干预细胞因子风暴主要与GRB2HTTIKBKEZBTB16PIK3R15个靶点有关。GO分析结果显示,在细胞组成方面主要与PML主体、核外围、转录阻遏物复合体等部位关系密切;分子功能方面主要与受体信号转导复合支架活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、DNA结合等密切相关;生物过程方面主要与细胞周期调控、细胞凋亡、信号转导等过程密切相关。

Pathway分析结果显示,麻黄干预细胞因子风暴主要与Tie2信号通路、GAB1信号小体、PI-3K级联等通路有关。结果选取−lgP值最大的3个结果进行分析,见图3

3.2.2  杏仁 结果显示杏仁干预细胞因子风暴主要与GRB2EGFRERBB3HTTPIK3R15个靶点有关。GO分析结果显示,在细胞组成方面主要与基底外侧质膜、质膜、核外围等部位关系密切;分子功能方面主要与跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、受体信号转导复合支架活性、DNA结合活性等密切相关;生物过程方面主要与信号转导、细胞周期调控、细胞凋亡等密切相关。Pathway分析结果显示,杏仁干预细胞因子风暴主要与a6b1a6b4整合素信号传导通路、GAB1信号小体通路、PTP1B介导的信号事件等通路有关。结果选取−lgP值最大的3个结果进行分析,见图4

3.2.3  大黄 结果显示大黄干预细胞因子风暴主要与WASEGFRPIK3R1GRB2IKBKE5个靶点有关。GO分析结果显示,在细胞组成方面主要与AP-2复杂转换器、胞浆、网格蛋白包被的囊泡等部位关系密切;分子功能方面主要与受体信号转导复合支架活性、细胞骨架蛋白结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等密切相关;生物过程方面主要与信号转导、细胞周期调控、细胞凋亡等过程密切相关。Pathway分析结果显示,大黄干预细胞因子风暴主要与GAB1信号小体、a6b1a6b4整合素信号传导、PTP1B介导的信号事件等通路有关。结果选取−lgP值最大的3个结果进行分析,见图5

4  讨论

麻黄、苦杏仁、大黄在新型冠状病毒诊疗方案中使用频次较高。麻黄味辛、微苦,性温,归肺及膀胱经,有宣肺平喘、发汗解表、消肿利水等功效,在现代药理研究中,麻黄及其提取物能抑制支气管肺组织中IL-13、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)蛋白的表达,下调IL-4IL-13IFN-γ等炎症因子水平,减轻哮喘小鼠气道炎症,可被用于治疗支气管哮喘[39-40]。苦杏仁味苦,性微温,有小毒,具有止咳平喘、润肠通便的功效。有研究表明苦杏仁能够抑制LPS刺激环氧化酶和iNOS在小鼠细胞的基因表达,抑制前列腺素合成和一氧化氮的产生,下调TNF-αIL-1β,进而发挥抗炎作用[41]。大黄性味苦寒,具有攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等功效。相关研究显示,大黄具有很好的抗病毒作用,其蒽醌类成分能够有效抑制病毒的合成,甚至有直接灭活病毒的作用。另外,大黄还可降低内毒素血症的阳性率及血浆内毒素浓度,抑制巨噬细胞的过度激活和细胞因子的过度分泌,防止或减轻急性感染中可能出现的内毒素血症,从而保护器官,降低病死率[42]。基于以上3味中药的抗炎作用机制研究,本文通过网络药理学方法,构建其与细胞因子风暴的关联网络,探讨中医药治疗重症COVID-19相关的作用路径和潜在的机制靶点,为临床治疗提供有价值的用药指导。

《黄帝内经》记载:“五疫之至,皆相染易,无问大小,病状相似。”在长期的中医药防治疫病临床实践中积累了不少的经验,在2003年抗击SARS过程中,中医药针对疫情发挥了自身特色与独特优势,尤其是在对抗细胞因子风暴、减少激素用量和缩短应用时间上,降低了一系列严重的不良反应。王福生院士团队发布的COVID-19首例微创病理报告显示,氧饱和度下降导致ARDS表现[43];现有临床数据显示COVID-192003SARS2015年国内MERS以及这几年的重症H1N1流感有一定的共性表现[44-45],因此,运用文献挖掘和网络药理学预测模式,借鉴既往中医药干预细胞因子风暴治疗SARSMERS和重症H1N1的疗效经验,随着现有COVID-19临床诊疗指南的推广实施和数据总结报道,以期为临床针对“细胞因子风暴”这一关键病理过程,在中西医结合治疗背景下,提高中医药治疗重症COVID-19患者的参与度提供文献依据,也为开发抗击COVID-19的中药新药提供筛选参考。

参考文献(略) 

来  源:刘闰平,葛俊德,钟  颖,郑  淇,孙  蓉. 基于干预细胞因子风暴文献挖掘的中医药治疗重症新型冠状病毒肺炎探讨 [J]. 中草药, 2020, 51: CNKI首发.

文献解读

文献解读:cytoscape进行模块和hub基因的筛选

2020-2-24 23:18:45

文献解读

文献解读:纯生信模型构建+免疫组化+动物模型

2020-2-26 15:59:48

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