曹玉杰等揭示微管负端相关蛋白介导的神经细胞微管骨架调控机制

图1,左侧为上海鲁班路立交桥【1】,右侧为超高分辨率的神经元胞体微管骨架图片【2】。红色为乙酰化微管,绿色为酪氨酸化微管
大脑是协调运动,控制身体其他器官,与高级认知功能紧密相关的重要器官,而神经元(Neuron)是大脑的基本组成单元。为适应其特殊的功能,神经细胞有着高度特化的形态和结构。一般来说,神经元是由多条较短的树突(Dendrite)和一条较长轴突(Axon)组成,分别行使接受和传递信号的功能。由于大脑需要与身体各个部分建立连接,所以形态上,神经细胞是人体最长的细胞。研究表明,细胞骨架,尤其是微管和微管相关的蛋白在调控神经元的结构功能方面有重要的作用。
神经元是高度极化的细胞,在形态和功能上具有不对称性(图2)。细胞骨架中的微管是由微管蛋白二聚体聚合形成的中空圆柱体,由负端向正端聚合。微管的正端和负端在结构和性质上也具有差异性。微管的正端(MT-plus Tip)更为动态和活跃,而负端(MT-minus Tip)更为稳定。基于微管的极性,其在轴突和树突中存在两种分布方式,即微管的正端(Plus-end-out MT)或者负端(Minus-end-out MT)朝向轴突和树突的远端,也被简称为正向微管和负向微管。早在1981年,人们就利用电镜成像技术观测到轴突中的均一的、正向微管。之后,Peter Baas课题组于1988年发现【3】,在树突中,微管的排布是非均一的,且同时存在正向和负向微管(图2,图3)。轴突中的,平行的、同向的微管结构更有利于马达蛋白(Motor Protein)主导的各种细胞内运输。相反,树突中这种反向平行的微管结构是不利于运输的,而这种结构与功能上的矛盾在当时也没有办法解释。随着科研技术手段的提升,相关领域的研究也取得了很多进展和突破,但目前为止,神经细胞轴突、树突中特化的微管结构的具体调控机制依然没有完全研究清楚。
图2,体外培养海马神经元微管结构示意图。
图3,左为1988年Peter Baas课题组的树突横断面电镜图(Hooking buffer处理)【3】,右为处理后微管结构示意图(参考【4】),紫色和深蓝色为微管固有的微管蛋白二聚体,黄色和浅蓝色代表buffer处理后形成的侧链。
2020年2月20日,荷兰乌得勒支大学Casper C. Hoogenraad团队(第一作者为曹玉杰Current Biology杂志上发表文章Microtubule Minus-End Binding Protein CAMSAP2 and Kinesin-14 Motor KIFC3 Control Dendritic Microtubule Organization揭示微管负端相关蛋白CAMSAP2与Kinesin14家族的KIFC3参与调控神经元中的微管结构。
研究人员发现Kinesin14家族的KIFC3对神经元的发育有重要的作用。通过mRNA干扰下调KIFC3蛋白的表达后,神经元树突分支受到影响。具体表现为树突的数目,平均长度和总长度有不同程度的下降。之后在小鼠大脑切片培养系统中再次验证了之前的表型,在KIFC3表达下调的情况下,神经元依然能顺利的迁移,但是之后树突无法正常发育。
研究人员进一步的检测了KIFC3在神经元里的表达。外源过表达全长的KIFC3蛋白在树突富集,并且能特异的结合乙酰化的微管。Kinesin14家族中的另一个蛋白KIFC1在轴突中通过滑动(Sliding)微管,促进轴突的生长和延伸【5】。但不同于KIFC1的蛋白结构,KIFC3只有一个微管结合结构域(MT Binding Domain),即Motor结构域。而KIFC1除了Motor结构域外,还有一个N端的微管结合结构域,因此KIFC1可以同时结合多根微管,使其彼此滑动。为了进一步探究KIFC3调控微管结构的机制,利用免疫沉淀和质谱结合的方法,检测神经系统中KIFC3可能的结合蛋白,然后发现了微管负端相关蛋白CAMSAP2。根据已有文献,CAMSAP2能通过稳定微管的负端,来稳定微管结构。通过生化实验,发现CAMSAP2通过两个Coiled-Coil结构域,结合KIFC3二聚体。在细胞水平上,研究人员利用全内反射荧光显微镜系统和激光切割技术,观测到了KIFC3和CAMSAP2能结合微管的负端。
根据KIFC3和CAMSAP2的相互作用,研究人员推测KIFC3可以通过CAMSAP2结合额外微管,从而调控微管组织和结构。接下来通过短期(Short-term)和长期(Long-term)两个角度检测了KIFC3-CAMSAP2与神经元树突中微管动态性的关系。利用微管正端标记物和活细胞成像技术(Live imaging),可以检测短时间(5分钟)内微管的动态性。研究人员发现在KIFC3和CAMSAP2下调的情况下,负向微管(Minus-end out MT)的动态性明显增加,稳定性下降。然后利用激光激活标记和活细胞成像技术,在长时间范围(3小时)检测微管结构的稳定性,发现KIFC3和CAMSAP2下调后,树突中微管结构变得更为松散,实验组的微管之间发生滑动,并向胞体移动。结合上述数据,研究人员推测KIFC3通过CAMSAP2识别结合微管的负端,同时将不同的微管彼此锚定、交联,形成更为稳定的微管结构。这种稳定的微管结构对于神经元的发育有着重要的作用。
最新研究【2】显示,在神经元树突中,负向微管更为稳定,并且乙酰化。而正向微管一般更为动态,并酪氨酸化。相同方向的微管在空间上彼此更接近。这一研究证明KIFC3-CAMSAP2蛋白复合物可以通过KIFC3的Motor结构域识别并结合乙酰化的负向微管,再通过CAMSAP2稳定、交联不同的微管,从而特异的将负向微管聚集结合在一起。这种同向微管的聚集可以促进囊泡、细胞器以及蛋白在树突中的运输效率。
绝大部分的马达蛋白在运输方面有更重要的作用,只有少数几种马达蛋白,包括Kinesin14家族的KIFC1,可以参与调控微管的结构和功能。该研究揭示了作为Kinesin14家族的KIFC3,也可以通过结合蛋白,特异的识别并调控负端朝外微管的结构,也揭示了一个树突微管调控的新的机制。目前大部分相关研究主要集中在微管的正端相关蛋白,但负端在神经元的发育中也有及其重要的作用,而且大部分分子水平的机制还没有研究清楚,值得今后进一步的研究。
图4,KIFC3和CAMSAP2调控微管结构模式图。原文链接:

https://doi.org/10.1016/j.cub.2019.12.056

1. http://www.sohu.com/a/298373418_682268
2. Tas, R.P., Chazeau, A., Cloin, B.M.C., Lambers,M.L.A., Hoogenraad, C.C., and Kapitein, L.C. (2017). Differentiation betweenOppositely Oriented Microtubules Controls Polarized Neuronal Transport. Neuron 96, 1264-1271 e1265.
3. Baas, P.W., Deitch, J.S., Black, M.M., and Banker,G.A. (1988). Polarity orientation of microtubules in hippocampal neurons:uniformity in the axon and nonuniformity in the dendrite. Proc Natl Acad Sci US A 85, 8335-8339.
4. Baas,P.W., and Lin, S. (2011). Hooks and comets: The story of microtubule polarityorientation in the neuron. Dev Neurobiol 71, 403-418.
5.Muralidharan, H., and Baas, P.W. (2019). Mitotic Motor KIFC1 Is an Organizer ofMicrotubules in the Axon. J Neurosci 39,3792-3811.
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