《癌生物学》第九章(1) p53——抑癌基因

“多细胞动物都能从自身组织中清除有缺陷或者失灵的细胞毫无疑问,高等生物自身的构成中就蕴含着死亡哺乳动物在它们的细胞内拥有一个忠实的护卫p53蛋白,后者保证细胞机能有条不紊。如果p53认为代谢紊乱或者基因组的损伤严重到无法修复的程度则放出信号激活细胞潜的自杀程序凋亡这将导致该细胞迅速死亡。”

1、p53的发现

  将被SV40 DNA肿瘤病毒转化的小鼠细胞注射到具有清楚遗传背景的小鼠体内时(同系宿主),宿主的免疫系统将针对只在被病毒转化的细胞中存在而正常小鼠细胞中不存在的核蛋白,产生抗体产生强烈反应这种蛋白质称为大肿瘤(largeT, LT) 抗原,病毒基因组的一段区域编T抗原是SV40病毒产生的具有多种功能的蛋质,用来扰乱被感染或者转化细胞的调控通路

  从携带SV40诱导肿瘤的小鼠中获得的抗大T血清,早在1979年,就被用来检测在SV40转化细胞中该蛋白质的存在。这个免疫沉淀物中除了大T, 还包含一个与其相互作用的蛋白质,分子量53~54kDa。使用p53蛋白的抗血清能在鼠胚胎肿瘤细胞中检测到这种蛋的存在,随后也在许多从未感染过SV40的人类和齿类肿瘤细胞中检测到了这种蛋白。

9-1-1X射线体衍射显示p53SV40T合:SV40T分子组装进p53同源六聚中,它的每个组分结合到一个单独的p53 分子上,并将之束缚

  用只识别大T的单克隆抗体能免疫沉淀到病毒感染的细胞中存在这一53~54kDa的蛋而在未被病毒染的细胞中则检测不到。这些发现揭示了在SV40转化的细胞中表达的大T抗原能和一种新发现的蛋白质结合,这种蛋白质被命名为P53能同时与大TP53反应的血清可以在一些未被感染的细胞中检测到P53值得注意的是,这些瘤细胞是通过非病毒机制转化的。随后的研究证实,P53来源细胞,而不是病毒。同年,有报道称化学致癌剂转化的小细胞同样表达P53, 进一步肯定了这一结论。

2、p53被认为是抑癌基因

  p53的功能研究绕了一个很大的路。最初,科学家发现在大胚胎成纤维细胞 (REF) 中共转染p53 cDNA 克隆和ras癌基因可以转化这些咄齿类动物的细胞。由于之前的研究发现myc可以与癌基因ras一起使咄齿类动物的细胞发生转化这说明p53 基因可能起与癌基因myc类似的癌基因的作用

  后来的研究发现事实并非如此。最初的p53 cDNA以肿瘤细胞的rnRNA为模板成,而随后从正常细胞中获得的p53 cDNA并不能使细胞转化,反而抑制了细胞的转化。在比较了这两种cDNA 序列后发现,两者之间的区别在一个碱基的替换这导致了P53 蛋白中一个氨基酸的改变。

  这些结果显示野生p53等位基因的实际功能是抑制细胞的增殖当其阅读框发生点突变时,就会获得促进细胞生长的功能。鉴于此p53基因被认为是一个抑癌基因。p53的等位基因点突变在很多人类肿瘤细胞的基因组中广泛存在。大研究数据显示,在30%~50%的人类肿瘤中都存在p53基因的突变实际上,在迄今所有人类肿瘤细胞基因组中,p53是发生突变频率最高的基因,在1/3的人类肿瘤中都以突变的形式存在

9-1-2p53等位基因在人类肿瘤细胞中突变的频率

 

  有趣的是,随后对于p53功能的分析显示,p53并不是一种典型的抑癌基因。大多数抑癌基因在小鼠生殖细胞中以纯合子的形式失活时,导致胚胎发育中断。这些抑癌基因似乎负调控多种类型细胞增殖来发挥作用,它们在细胞调控通路中的缺失将导致一些细胞的不正常增殖,从而中断其正常发育。

  与之相反的是,小鼠生殖细胞中两个p53基因拷贝的完全缺失对于绝大多数的p53-/-胚胎的发育并无明显影响。因此,p53不能被简单地认为是正常细胞发育中增殖的负调控因子。这个特点第一次提示了P53蛋白并不操纵增殖,或者非增殖信号从而持续影响细胞调控其增殖。相反,P53似乎是特异地阻止非正常细胞的出现,尤其是那些有可能发展成肿瘤的细胞。

9-1-3将编码Ras癌蛋cDNA与多种不同剪切形式的p53 cDNA共转染到大鼠胚胎成纤维细胞中p53缺失突变载体中(左),几乎缺失了全部的p53阅读框,只形成了很少的聚p53点突变的情况下(中),大聚集点形成在野生型p53的克隆中(右)几乎没有聚点的形成

3、突变的p53干扰正常p53的功能

  第7章讲到,只有抑癌基因由于两次连续失活突变而被去除,或者一个失活突变与杂合性缺失(LOH)同时发生时,才能出现细胞表上实质性的变化。然而,小鼠生殖细胞中两个p53基因拷贝的完全缺失对于绝大多数的p53-/-胚胎的发育并无明显影响p53基因似乎并没有遵循抑癌基因丢失的双击理论

  解决突变的p53蛋白如何促进肿瘤细胞形成这个难题主要通过两个方面的方法。

是对于酵母遗传学方面的研究表明,某个突变的等基因可以在由突变而失活的个基因产物中发现该基因的等位基突变同时,这个突变使得突变后的等位基因能够干扰或者妨碍细胞中那个剩下的野生拷贝的正常活性。这种类别的等基因被命名为差异显性干扰或显性负等位基因。另一个是对于P53蛋白的生物化学分析,P53是一个核蛋白一般以同源四聚体的形式存在于细胞中

  将显性负效应和四聚体形态联系在一起可以推测出突变的p53等位基因能有效地干扰在同一个细胞中表达并持续起作用的野生p53等位基因。假设人类肿瘤细胞中存在一个突变的p53基因,编了一个失去正常功能但仍能形成四聚体的P53蛋白。如果这个突变的等位基因和野生的等位基因在此细胞中共存 ,那么这个细胞中的P53四聚体将是包含了突变的P53及野生P53

9-1-4p53作为显性负等位基因在含有单个突变p53等位基的细胞中,会形成包含不同比例的野生型(蓝色)及突变型(红色)P53亚基组成的四聚体。由于单独一个突变的亚基都可能导致整个四聚体功能的丧失因此在p53基因杂合的细胞中,15/16的蛋白质都缺乏完整的正常功能

 

  将一个突变的p53 cDNA克隆导入(转染)含有一对野生型p53等位基因的细胞中, 这个导入的等位基因通常带有一个高活性的转录启动子,比细胞自身的 p53拷贝启动子活性高得多。所以,在这种转染的细胞中,突变的p53蛋白表达量会比内源性的正常p53高得多。因此,在这种细胞中,完全由野生p53亚基形成的p53四聚体所占的比率远远少1/16。这解释了为什么导入的突变p53等位基因能够高效地影响这些细胞中p53的功能。

9-1-5人类肿瘤中发现的绝大多数的p53等位基因的突变为错义突变(点突变),而其他肿瘤抑制基因或管家基因 (ATM, BRCA1)中的突变多为阅读框移位或无义突变

  按逻辑,许多人类肿瘤细胞在失去p53功能后取得优势,可能是于它们携带了一个野生型和一个突变型的等位基因。实际上,在p53基因座突变的大多数人类肿瘤细胞中,都发现了p53基因的杂合性缺失,这些细胞中野生型的等位基因被清除,产生了具有两个突变p53的等基因。因此在这些细胞中,当一个p53基因在开始时突变接下来剩下的野生型p53基因也通过杂合性丢失机制被清除。

4、P53蛋白半衰期较短

  早在P53DNA结合结构域被发现之前,该蛋在许多正常细胞或者肿瘤细胞的核定位就提示了它可能作为一个转录因子来发挥功能。已知至少3种调控转录因子活性的机制:1.调控转录因子在核内的水平2.转录因子在核内的水平保持恒定,但其活性必须由一些共价修饰辅助3.调控某个共同转录因子水平P53来说第一种机制,即P53的水平改变是主要的。

  许多细胞中的蛋白质分子,一旦被合成就能持续数十小时或者数百小时。同时,许多其他蛋白质的代谢是高度不稳定的,几乎一合成就被降解区分这两类蛋质的一个方法是用放线菌酮处理细胞,这是一种能抑制蛋白质合成的药物。

  在对具有野生p53等位基因的细胞进行放线菌酮处理后,测得P53蛋白的半衰期大约只有20min这说明P53是一种高不稳定的蛋质,在被合成后不久即被降解,因此其调控更为迅速,可以通过增加或者降低其稳定性来完成

参考书目:《The Biology of Cancer》(Second Edition)  R.A.Weinberg  著,詹启敏 等  译
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