CRISPR-Cas9全程实操教程:从gRNA设计到挑单克隆全程指导

基本原理

CRISPR-Cas9是一种细菌获得性免疫,用于降解入侵的外源DNA。CRISPR RNA (crRNA) 与转录激活crRNA (Trans-activating crRNA, tracrRNA) 退火形成的复合物能特异性识别与其互补的基因组序列,引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂,如下图所示。


通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造,将其连接在一起得到sgRNA (single guide RNA)。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行基因操作,在PAM (5’-NGG) 上游 ~3bp进行切割,如下图所示。

因此本实验的关键步骤是设计一对20bp(不包括NGG在内的)完全互补的oligo插入到如上图所示的filler。另U6启动子需要5’端的G起始转录,因此若设计的oligo第一个碱基非G,需额外增加一个G。

 

操作详细流程

 
1. 设计sgRNA

关于sgRNA的设计我们有专门开过一篇文章《一文掌握gRNA的设计,常用方法汇总解析》

确定靶基因的序列,可通过在线网站设计(http://tools.genome-engineering.org ),或根据靶基因的CDS序列自行设计,最方便的是在human KO Library sgRNA里选择。无论选择哪种方式,都建议进行一下blast。

附上在线设计网页截图。输入基因的name,填写email address,设计结果稍后会发送到此邮箱,选择序列的类型以及物种。如sequence type选择unique region,一次只能输入23~500bp的基因片段,最好一次只输入一个外显子,避免guide序列跨越内含子,都选择键入后点击提交,关注邮箱或者在线等。

分析中,显示你所键入的基因序列里有36对可选的guide序列。
分析结束,点击Download as genbank查看结果,此时也会收到邮件。


选择分数较高的Guide序列,以Guide#1序列为例,2条单链oligo的序列如下:oligo1:5’- caccG CGTTCAAGTACCAGTTCGTG -3’; oligo2:5’- aaac CACGAACTGGTACTTGAACGc。标红部分与经BsmBI酶切后的载体互补配对。BsmBI又名BbsI。


※oligoDNA序列的第一个碱基必须是G,如选取的Guide序列的第一个碱基不是G,需自行添加一个额外的G。

2. Oligo退火形成duplex


PCR仪 95℃ 5 min,缓慢降温至室温1h,1:200稀释duplex。

 
3. 质粒酶切

 
4. 胶回收

大片段约11kb 回收;小片段约2kb为切下来的filler,不要。

 
5. 连接

室温连接4-6 h。

 
6. 转化(Amp+),挑克隆,摇菌,抽提质粒,测序!
 
7. 转染
24孔板,细胞不要过满,同实验室日常转染操作,可选择性设置三个平行。同时转染空载作为阴性对照。每孔500 ng。

 
8. puromycin筛选

转染稳定48-72h后加puromycin进行筛选,1~3g/mL,直至不再有细胞数量稳定,不再有细胞因不耐药死去。

 
9. 单细胞分离

由于篇幅原因,有限稀释法具体细节会在后面的文章单独讲解,请关注科研小助手后续文章。100个细胞铺在一个大盘或96孔板中。剩余的细胞冻存。

 
10. 获得单克隆细胞株

当肉眼可见类似于菌落的细胞团时,将其从大盘或96孔板消化下来转移至12或24孔板中继续扩大培养。注意不要污染到其它细胞团,不要选取过密的细胞团。

 
11. 扩大培养,提取细胞全基因组DNA和细胞总蛋白

12. 测序

Guide序列上游100bp左右和下游200bp左右为上下游设计一对引物,以全基因组为模板,以上述引物进行PCR。PCR产物送测序,或将产物用T7E1进行酶切消化检测突变。

13. Western

与阴性对照相比,靶基因应完全敲除

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