文献解读:功能基因的顶级科研思路

最近大家都追捧外泌体、非编码RNA等热点,但并不是什么分子新就一定要做什么,选择最适合自己的,课题组有一定工作基础的,任何分子类型都可以胜任文章基金的需求。
酸菜大大说过蛋白作为最后是执行功能的单位,研究蛋功能基因永远不过时,把细节做到位,功能基因也能发一篇很好的文章
 
废话不多说,接下来带大家一起欣赏一篇HEPATOLOGY的文章,感受一下功能基因的顶级套路。
 
文章标题是“PRDM8 Exhibits Antitumor Activities Toward Hepatocellular Carcinoma by Targeting NAP1L1“。
 
题目四要素:
首先,主变量分子是PRDM8功能是抑癌,疾病是肝癌,机制是能够靶向结合NAP1L1基因。
从题目看本文就是一个分子+分子二元结构,但通过摘要发现PI3K/AKT/mTOR通路。
因此,我们得出科学假设:分子PRDM8通过靶向分子NAP1L1调控PI3K/AKT/mTOR通路从而抑制肝癌发生发展,这算一个分子+分子+通路的三元直接机制结构。

本文包括了分子、细胞、动物、组织四个维度,由于图片数量限制,正文只有8个figures,故补充材料里的图表也显得格外的重要,内容可以分为4部分
 
第一部分(组织水平),包括figure1、S1,TableS1、S2,论证PRDM8分子在肝癌组织中的表达情况;
第二部分(细胞水平),包括figure2、3、S2、S3,过表达和沉默PRDM8一正一反表型验证;
第三部分(动物水平),包括figure4,5,通过移植瘤、转移瘤模型进行表型验证;
第四部分(分子水平),包括figure6、7、8、S5、S6、S7此部分为机制研究。
 
接下来,让我们一起看图知全文。
 
第一部分:组织水平
 
Figure1,PRDM8在肝癌中低表达,预后好
 
A、B图:PCR显示60对配对临床样本中,PRDM8 mRNA在肝癌组织中的表达量显著低于癌旁组织;
C图:westernblot显示PRDM8蛋白在肝癌组织中的表达量显著低于癌旁组织;
D图:免疫组化显示肝癌组织中PRDM8的表达降低;
E图:预后生存曲线图提示PRDM8高表达的患者的无复发生存率和总体生存率均高于PRDM8低表达的患者。
 
补充材料FigureS1中A图:398对石蜡切片进行免疫组化检测,提示PRDM8在肝癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织;B图:组织芯片检测又一次验证PRDM8在肝癌组织中的表达是下降的。
 
第二部分:细胞水平
 
首先,在FigureS2A、B图中,作者检测了PRDM8mRNA及蛋白在7肝癌细胞株中的表达,结果显示相比较LO2细胞,PRDM8在SMMC7721和YY8103细胞株中表达相对更低,故对其进行了过表达操作;而在Focus和HepG2细胞株中表达相对高于其它细胞株,故对其进行了沉默操作;C、D、E图:从转录及蛋白水平验证操作效率。
 
接下来进行单变量论证:
Figure2,过表达PRDM8可以抑制肝癌细胞增殖、转移及侵袭
A图:CCK8检测结果显示PRDM8过表达后肝癌细胞增殖减慢;
B图:克隆形成实验显示PRDM8过表达后克隆形成数目减少;
C图:划痕实验显示PRDM8过表达后细胞迁移能力减弱;
D图:Transwell实验显示PRDM8过表达后细胞侵袭能力减弱;
 
Figure3,PRDM8能够调控G1-S期转化,并促进细胞凋亡
 
A图:PRDM8过表达导致细胞停滞于G1期;
B图:敲减PRDM8后,S期细胞比例增多;
C图:PRDM8过表达后肝癌细胞凋亡增加;
D图:敲减PRDM8后,肝癌细胞凋亡减少。
FigureS3显示PRDM8敲减后可以促进肝癌细胞增殖、转移及侵袭,做到了“一正一反”。
 
第三部分:动物水平
 
Figure4,PRDM8抑制移植瘤的生长
 
A图:PRDM8过表达后,肿瘤体积变小,重量减少;
B图:敲减PRDM8后,肿瘤体积变大,重量增加;
C图:动物标本HE染色、IHC检测PRDM8及增殖markerki-67、TUNEL染色显示在过表达PRDM8的移植瘤组织中细胞增殖减少、凋亡增加。
 
Figure5,PRDM8抑制肿瘤转移
 
A图:光量子通量检测法显示PRDM8过表达抑制转移的发生;
B图:光量子通量检测法显示敲减PRDM8可促进转移的发生;
C图:尾静脉注射观察肺部结节,PRDM8过表达减少了肺部结节数量;
D图:尾静脉注射观察肺部结节,敲减PRDM8增加了肺部结节数量;
E图:各组肺结节的数量;
F图:生存曲线图显示PRDM8过表达组裸鼠总体生存率高于对照组;
G图:生存曲线图显示敲减PRDM8后裸鼠的总体生存率低于对照组。
 
第四部分:分子机制
 
Figure6,PRDM8抑制PI3K/AKT/mTOR通路
 
A图:westernblot显示PRDM8过表达后AKT、mTOR磷酸化减少;
B图:western blot显示敲减PRDM8后AKT、mTOR磷酸化增多;
C图:western blot显示PRDM8过表达后细胞周期、凋亡、肿瘤转移相关蛋白的变化,其中细胞周期G1期标志物(Cyclin D1,Cyclin E1, CDK2,CDK4, CDK6)降低,抑癌基因p27增加,转移相关标志物(MMP2,MMP9)降低,血管内皮因子VEGF降低,凋亡相关标志物bcl-2下降,而剪切后Caspase-3和Bax增多,提示PRDM8过表达后细胞周期停滞于G1/S期,细胞凋亡增加,转移能力减弱;
D图:western blot 显示敲减PRDM8后得到了C图相反的结果。
 
Figure7,PRDM8通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路抑制肝癌
 
A图:加入IGF-1后,AKT、mTOR磷酸化增加,通路激活;
B图:PRDM8过表达后加入通路激活剂,细胞增殖能力增加;
C图:PRDM8过表达后加入通路激活剂,细胞迁移能力增加;
D图:PRDM8过表达后加入通路激活剂,细胞侵袭能力增加;
E图:加入通路激活剂后,G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加;
F图:加入通路激活剂后,凋亡细胞减少。
 
FigureS4显示PRDM8敲减的细胞中加入通路激动剂,同样可以回复表型。
 
Figure8,PRDM8与NAP1L1靶向结合
 
A图:质谱分析与PRDM8相结合的蛋白;
B图:co-IP运用PRDM8抗体验证与分子NAP1L1结合;
C图:co-IP运用NAP1L1抗体验证与分子PRDM8结合;
D图:PCR检测60对配对临床样本中NAP1L1mRNA表达水平,提示NAP1L1在肝癌组织中表达增高;
E图:相关性分析显示PRDM8与NAP1L1表达呈负相关;
F图:免疫荧光显示PRDM8与NAP1L1的定位相似;
G图:NAP1L1在PRDM8过表达的细胞中表达减少;
H图:NAP1L1在PRDM8敲减的细胞中表达增加;
  
FigureS5,PRDM8通过NAP1L1抑制PI3K/AKT/mTOR通路活性从而抑癌
 
A图:在PRDM8过表达SMMC7721细胞中过表达NAP1L1;
B图:同时过表达PRDM8和NAP1L1后PI3K/AKT/mTOR通路被激活;
C、D、E、F图:同时过表达PRDM8和NAP1L1后细胞增殖、迁移及侵袭能力增加;
G、H图:同时过表达PRDM8和NAP1L1后S期细胞比例增加、细胞凋亡减少。
 
FigureS6,PRDM8通过NAP1L1抑制PI3K/AKT/mTOR通路活性从而抑癌
 
A图:在PRDM8敲减的HepG2细胞中敲减NAP1L1;
B图:同时敲减PRDM8和NAP1L1后PI3K/AKT/mTOR通路被抑制;
C、D、E、F图:同时敲减PRDM8和NAP1L1后细胞增殖、迁移及侵袭能力减弱;
G、H图:同时敲减PRDM8和NAP1L1后G1期细胞比例增加、细胞凋亡增加。
 
FigureS7,过表达PRDM8同时敲减NAP1L1可以协同抑癌
 
A、B图:过表达PRDM8的同时敲减NAP1L1后细胞增殖、侵袭能力进一步减弱;
C图:根据以往研究报道,NAP1L1敲除后的肝星状细胞出现GAB1分子的下降,而GAB1被报道是PI3K/AKT/mTOR通路重要的上游调节因子,故作者猜测NAP1L1是通过调控GAB1激活PI3K/AKT/mTOR通路,westernblot结果显示NAP1L1过表达后GAB1水平升高,NAP1L1敲减后GAB1水平降低。
总结一下,本文是一个分子+分子+通路三元变量结构,论证了主变量分子PRDM8通过与NAP1L1结合调控PI3K/AKT/mTOR通路从而抑制肝癌的发生发展,其中包括一个分支,NAP1L1可能通过调控GAB1从而调控PI3K/AKT/mTOR通路,分为以下三步论证
 
单变量论证:PRDM8抑制肝癌增殖、迁移及侵袭,促进G1/S期停滞、细胞凋亡,有多株高表达/低表达细胞模型,细胞动物双重论证,但唯一的缺陷是每个表型缺乏多实验验证;
二元变量论证:PRDM8通过NAP1L1抑制PI3K/AKT/mTOR活性从而抑癌,PRDM8调控通路,PRDM8调控NAP1L1,PRDM8调控通路、表型通过NAP1L1,有上下调控关系,有“反正正”、“反反反”表型回复;
直接作用论证:首先用IP找到结合的分子,然后用co-IP正反验证分子间的结合。
 
本文之所有能发这么高的分数,首先,主变量分子存在一定创新性,之前只报道过2篇文章,但在肝癌中的作用是首次报道;
其次,态度端正,本文最大的特色就是论证结构非常完整,包括了临床、细胞、动物、分子四个维度,而且每个维度都从多个角度来验证,临床水平包括配对样本60对、石蜡块398对、组织芯片检测,并统计生成了单因素表(TableS1)、多因素表(TableS2)及预后生存曲线图;细胞水平有正反回复、直接机制;动物水平包括靶基因过表达、沉默的功能表型验证,也有标志物的检测;分子水平包括蛋白-蛋白直接机制。
 
因此,对于基金不够充足、平台不够强大的同学,功能基因无疑是一款不错的选择,做好了也可以发高分文章。
好了,这篇文献就分享到这里,期待大家都能收获好的结果。
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