弓形虫分化主要调控因子的鉴定

病原体可以通过建立潜伏性或慢性状态、延缓复制避免被清除、改变免疫原性和减少对宿主的影响来延长感染期,对治疗和根除传染性疾病造成障碍。慢性期(chronic stages)在顶复门病原体的生命周期中有重要作用,如肝脏内间日疟原虫的休眠体,使之对多种抗疟药物具有抗性,导致潜伏时间长,随后出现明显的感染。弓形虫速殖子(Toxoplasma gondii tachyzoites)能够侵入恒温动物的有核细胞,传播到全身,通过裂解宿主细胞引起病理学改变。一部分速殖子分化成生长缓慢的缓殖子(bradyzoites),在脑和肌肉组织中形成细胞内囊肿【1】。免疫系统或目前的治疗无法完全消除这些囊肿,因此,世界上多达四分之一的人口长期感染弓形虫。而弓形虫感染对免疫功能低下者具有致命性,其中大多数由复发性感染导致。
 
快速增殖的速殖子分化为形成囊肿的缓殖子伴随着以下变化:弓形虫复制的寄生液泡的囊壁被修饰成一个高度糖基化的囊壁,含有多种功能未知的阶段特异蛋白;寄生虫的代谢依赖于厌氧糖酵解而不是有氧呼吸,并积累细胞质淀粉颗粒;同时伴随着成百上千的基因发生差异性调控。细胞培养中,碱性pH、热休克、小分子和营养缺乏等多种条件能够诱导其分化【2】,但是驱动向缓殖子分化的分子机制仍然不清楚。
 
2020年1月16日,美国whitehead研究所的Sebastian Lourido团队在Cell杂志上发表文章Identification of a Master Regulator of Differentiation in Toxoplasma通过Cas9筛选和单细胞测序鉴定出BFD1是弓形虫分化过程中重要的调控因子。应激条件导致BFD1累积,其合成表达驱动分化过程。而且,BFD1可以结合很多阶段特异性基因的启动子,与主导寄生虫基因调控的ApiAP2相对应。BFD1可作为研究和控制弓形虫分化的基因开关,并将为慢性感染的预防和治疗提供信息。
 
研究人员首先将弓形虫ME49品系改造成报告品系:结构性表达RFP,缓殖子特异基因BAG1启动子驱动绿色荧光蛋白mNG表达,表达Cas9基因高效敲除系统。碱性条件诱导报告品系的弓形虫分化,导致mNG+比例增加,即缓殖子。RNA-seq分析速殖子和缓殖子的基因表达,发现缓殖子中1311个基因被上调、933个基因被下调。上调的基因包括经典的缓殖子特异性基因BAG1、LDH2、ENO1,而重要的速殖子表面抗原SAG1则被下调,与之前的数据库相一致。研究人员利用2个文库进行Cas9筛选,文库1主要靶向RNA-seq中差异调控的基因,文库2主要靶向具有转录因子的常见DNA结合域的基因,如锌指和Myb样结合域。2个文库涵盖了ApiAP2转录因子家族的67个成员和151个假定的核酸结合蛋白。结果显示,仅有一个基因TGME49_200385影响弓形虫的分化过程,命名为BFD1(Bradyzoite-Formation Deficient 1)。BFD1是一个未注释的基因,编码由2415个氨基酸组成的蛋白,包含两个串联的SANT/Myb样DNA结合结构域,与c-Myb同源且在囊性球虫中保守。碱性应激条件下,野生型(WT)弓形虫的寄生液泡开始分化,而失活突变BFD1(ΔBFD1)则未检测到分化过程;BFD1缺失的弓形虫中回补野生型BFD1(ΔBFD1:BFD1WT)能恢复分化,而缺失Myb结构域则不行。BFD1缺失导致自发性或小分子Compound1诱导的分化受损。利用弓形虫感染小鼠发现,WT、ΔBFD1、ΔBFD1::BFD1WT三种基因型的弓形虫的发病率和死亡率类似,表明BFD1不影响弓形虫感染的急性症状。WT、ΔBFD1::BFD1WT感染形成脑部囊肿,一个囊肿围绕着数百个缓殖子,而每只鼠的囊肿数量从数百到数千不等,然而ΔBFD1感染的小鼠中未检测到囊肿。即弓形虫中缺失BFD1导致动物感染过程中的特异性丢失形成组织囊肿的能力。
 
为了研究WT、ΔBFD1的分化不同步过程以及ΔBFD1所导致的缺陷程度,研究人员对非应激和应激条件培养的WT、ΔBFD1弓形虫进行了单细胞测序。共鉴定出7个clusters,其中cluster 0和1是G1期样,2、3、5、6是S/M期样。对基因表达谱进行分析发现细胞周期以逆时针方向在图上展现,且G1:S/M=60:40与之前的报道一致。从速殖子和缓殖子角度分析,发现碱性应激条件下,WT弓形虫迅速脱离速殖子细胞周期,进入缓殖子的clusters,而且阶段性基因特征上调表达。非应激条件下,ΔBFD1弓形虫的分布与WT类似;但应激条件下,ΔBFD1弓形虫继续停留在速殖子的复制中,不能上调表达缓殖子特异基因,且7.2%的ΔBFD1弓形虫聚集在S/M期速殖子,88.6%聚集在G1期,表现出死亡的特征。即BDF1对弓形虫分化是必需的,在碱性应激压力下,ΔBFD1弓形虫无法正确响应这种应激而开始死亡。
 
BFD1的mRNA水平在不同阶段都恒定表达,与编码速殖子蛋白的基因水平相当,但BFD1蛋白只在应激条件下表达,意味着BFD1具有应激压力依赖的翻译机制。在ΔBFD1弓形虫中回补可诱导型BFD1(ΔBFD1/DD-BFD1-Ty),诱导BFD1表达可防止单层细胞溶解,伴随出现大的囊样空泡,而且DD-BFD1-Ty在细胞核内大量积累,在没有应激压力条件下诱导95%以上的弓形虫分化。同时,585个基因上调、655个基因下调,包括了多种经典的阶段性特异基因,且76%的上调基因、45%的下调基因与野生型应激压力下诱导的基因重叠。因为BFD1具有DNA结合结构域,研究人员最后检测了BFD1在全基因组的分布状况。全基因组水平共鉴定出815个分布峰(peaks),其中652个对应到509个基因。BFD1的结合位点偏向于转录起始位点附近,高质量的分布峰通常与应激条件上调的基因相关。BFD1结合基序(binding motif)的存在可预测碱性应激下的差异调节,上游结合基序的数量与差异表达的程度相关。BFD1分布在缓殖子的多种差异表达基因上游,如典型的阶段特异性基因BAG1、LDH2、ENO1、AP2IX-9,且BFD1可以与自身启动子上游结合。
 
总的来说,文章通过Cas9文库筛选鉴定出BFD1是弓形虫分化的主要调控因子,而且从单细胞测序、基因敲除、回补试验等证明了BFD1对弓形虫分化的充分必要性,最后揭示了BFD1作为转录因子结合缓殖子特异性基因调控分化过程,为我们理解弓形虫的分化提供了新的视角。
 
原文链接:
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.12.013
1. Dubey, J.P., Lindsay, D.S., and Speer,C.A. (1998). Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, andsporozoites and biology and develop- ment of tissue cysts. Clin. Microbiol.Rev. 11, 267–299.
2. Radke, J.R., Donald, R.G., Eibs, A., Jerome, M.E., Behnke, M.S.,Liberator, P., and White, M.W. (2006). Changes in the expression of human celldivision autoantigen-1 influence Toxoplasma gondii growth and development. PLoSPathog. 2, e105.
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