骆利群/Alice Ting合作利用原位蛋白组学方法揭示大脑中神经元联结的调控分子

在多细胞生物的进化过程中,单个细胞通过细胞表面的信号传输通路与其他细胞进行通讯,进而组装成高度分化的组织并协同执行生理功能。因此,细胞表面信号传导控制了多细胞生物发展和生理的诸多方面。以神经系统为例,细胞表面的联结分子(wiring molecules)决定了发育过程中神经网络的精确组装,神经递质受体和离子通道介导突触传递和可塑性。特定于细胞表面的蛋白质组学不仅可以揭示它们的整体情况和动态变化,还可以用来研究在特定阶段富集的单个分子的功能。现有方法可在体外培养的细胞中实现细胞表面蛋白质组学分析,但是体外细胞失去了不可或缺的体内组织环境。因此,在完整器官内,原位地描绘特定类型细胞的表面蛋白动态组成,对于理解包括大脑在内的复杂多细胞系统的组织原理和运行机制至关重要。

 

2020年1月16日,来自斯坦福大学的两位华人科学家,骆利群教授(美国科学院院士,艺术与科学院院士,HHMI研究员)Alice Ting教授及其团队(博士生李介夫韩硕为该论文的共同第一作者)Cell杂志上合作发表了题为 “Cell-Surface Proteomic Profiling in the Fly Brain Uncovers Wiring Regulators” 的文章 。

 

该工作发展了一种高时空分辨率的蛋白组学技术,通过基因编码的过氧化氢酶HRP(horseradish peroxidase)直接在完整果蝇大脑内对指定细胞类型的表面蛋白组进行高精度的生物素标记,富集和分析。基于这一方法,作者对幼虫和成年果蝇两个时间点大脑嗅觉系统投射神经元(projection neuron)的表面蛋白组的动态变化进行了定量分析,揭示了从发育到成熟过渡过程中神经元联结分子的整体下调和突触分子的整体上调。基于蛋白组学的数据而进行的体内筛选发现了细胞表面20个调控嗅觉系统神经回路的新分子,其中大多属于以前认为与神经发育无关、进化保守的蛋白家族。遗传分析进一步表明,脂蛋白受体LRP1(low-density lipoprotein receptor protein 1)可自主控制嗅觉细胞树突的靶向,从而有助于形成精确的嗅觉回路。

      

为了发展适用于完整器官的生物素邻位标记技术,作者首先通过遗传学手段在指定的细胞中表达定位于细胞表面的HRP,并利用一种不能穿透细胞膜的生物素小分子实现高特异性细胞外标记反应。在通过荧光成像和免疫印迹等手段验证和优化上述方法之后,作者对果蝇大脑发育的两个不同时期进行了蛋白组学分析,得到了空间上细胞表面特异性极高的蛋白组,以及各个蛋白在不同发育阶段的定量变化关系:在幼虫的神经元表面,与神经发育和神经回路联结相关的蛋白被高度富集;而与突触信息传递、离子通道等相关的分子则在成年大脑中被富集。值得一提的是,这种蛋白组学方法一次性就发现了绝大部分过去几十年内逐一被研究的重要联结分子。

 

为了研究幼虫表面富集但目前未知与神经发育相关的蛋白质,作者设计了一套体内筛选方法,通过RNAi降解的手段详细研究了20个蛋白对于神经发育的影响,并发现研究的20个蛋白全部对于神经发育有重要作用。令人惊喜的是,这些新发现的分子中很多属于意料之外的蛋白家族,比如一些脂肪酶、肽酶等。它们在进化上高度保守,却第一次被发现与神经发育相关,这极大的拓展了研究调控神经回路分子机制的外沿。最后,作者选取了其中一个蛋白,LRP1,进行了详细的遗传学分析,确认了其在调控嗅觉系统投射神经元树突的靶向的重要作用。

 

总之,该文章发展了一种针对完整组织器官中指定细胞类型的表面蛋白组学技术,具有极高的时间和空间分辨率。作者将该技术应用于研究果蝇大脑中嗅觉神经元的发育过程,发现和验证了一系列此前未知的重要调控分子。

 

有趣的是,韩硕/李介夫两位作者两年前就曾撰写综述Proximity labeling: spatially resolved proteomic mapping for neurobiology(Han*,Li*  et al, Curr. OpinNeurobiol 2018, *co-first author),详细展望了此类蛋白组学技术对于神经生物学巨大的推动作用。类似的研究思路和方法未来可更进一步用于研究复杂组织器官在各种生理状态下(比如稳态或癌变)不同细胞类型之间的表面信号传输机制。

 
图.神经表面测绘师(credit: Julia Kuhl)
原文链接:
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.12.029
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