文献解读:头颈鳞癌单基因突变

今天跟大家文献解读的是2019年十二月份发表在frontiers in Oncology杂志上的一篇文章,文章主要以湿实验为主。

SMAD4 Somatic Mutations in Head and Neck Carcinoma Are Associated With Tumor Progression

头颈鳞状细胞癌SMAD4 体细胞突变与肿瘤进展相关

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC),包括口腔鳞状细胞癌,是全球第六大最普遍的恶性肿瘤。 HNSCC的发病机制受许多分子因素的影响,TCGA的全外显子测序(WES)显示HNSCC中具有显著突变的新基因。

SMAD4是SMAD家族的转录因子,其参与TGF-β信号传导。在过去20年研究中发现仅SMAD4功能丧失并不能引发肿瘤,但可能会促进由其他分子缺陷(如KRas的激活)引发的肿瘤的进展。SMAD4的丧失在对DNA损伤的反应中起着至关重要的作用。

这项工作中,研究了HNSCC中的SMAD4突变。发现SMAD4的突变及其表达水平与HNSCC的进展有关,并影响患者的生存。

 

数据

122个手术切除的HNSCC样本(Mackay Memorial Hospital,中国台湾),术前均未接受放疗或辅助化疗。血液和癌组织中提取DNA

 

结果

一、SMAD4的体细胞突变和LOH

1. 为了评估SMAD4在临床患者中的表现,对122HNSCC患者的SMAD4基因进行测序(NGS)和杂合性缺失(LOH)分析。在患者中识别到了SMAD47个体细胞突变,其中2个是同义突变,5个是错义突变(图1A,B)。在28(22.95%)个患者中,至少发现一个LOH标志(本工作使用三个接近SMAD4 位点的多态性标志:D18S363,D18S474D18S46),17(13.93%)个患者中有23LOH标志(图1A)。90个患者没有突变或LOH

 1.HNSCC患者中SMAD4突变及LOH情况

 

2. 相比淋巴结未转移患者,有淋巴结转移的患者的突变、LOH频率高(图2C)。在临床分级、肿瘤大小、嗜神经侵袭、淋巴血管渗透上没有显著区别(图2A-E)。对患者划分两组(SMAD4野生组、SMAD4突变或LOH或既突变又LOH组)进行生存分析,结果显示,有SMAD4突变或LOH的患者生存差(图2F-G)。COX回归分析显示SMAD4突变或LOH的患者有较差的DFSOS(表1)。

 2.SMAD4 LOH和突变的临床/病理学参数比较及生存分析

 

 1.SMAD4 LOH和突变相关的COX回归分析

 

二、SMAD4HNSCC患者中的表达

在癌旁正常口腔上皮细胞、肿瘤细胞中分别检测SMAD4表达(图3A),在肿瘤组织中,SMAD4的表达从弱到强不等。研究发现SMAD4低表达与临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移相关(图3B-G)。SMAD4的表达与LOH和突变状态、嗜神经侵袭和淋巴血管渗透无关。生存分析显示SMAD4低表达患者生存差(图3HI)。但是多变量Cox回归分析显示,SMAD4表达与OS之间的相关性仅略显著。

 3.SMAD4 表达相关的临床/病理学参数比较及生存分析

 

三、SMAD4敲除与增加HNSCC侵袭能力的关联性

SMAD4在正常的人类口腔角质细胞(NOKs)和HNSCC细胞中的蛋白表达(图4A)。57.1%HNSCC细胞系相比于NOKs有表达降低或者没有蛋白表达的情况。

为了进一步阐明SMAD4的致癌作用,在SASSCC25这两个HNSCC细胞系中敲除SMAD4(图4B),发现敲除SMAD4没有影响细胞增殖(图4CF),但细胞迁移和入侵显著增加(图4D,E,G,H)。

 4.SMAD4 敲除相关分析

 

四、SMAD4突变与增加HNSCC侵袭能力的关联

为了表征SMAD4对表型的影响,从SAS细胞系中扩增出SMAD4的全长编码区,并克隆得到SMAD4结构体。在肿瘤样本中,SMAD4有三个错义突变 (p.His132Tyr,p.Pro296Thr, and p.Ala488Val),这些突变分别位于MH1LinkerMH2区域(图5A)。

在FaDu和 OECM1(没有或者只有低SMAD4表达)细胞系中构建SMAD4突变,湿实验研究SMAD4表达变化(图5B,C)。外源的SMAD4表达减少了FaDuOECM1细胞系的迁移和入侵(5E,F,H,I)。突变体p.H132Y被转染后,细胞系中由SMAD4过表达而抑制的表型消除了。转染的细胞系增殖率未被影响 (5D,G)。然而,p.P296Tp.A488V突变体并没有消除SMAD4过表达对入侵和迁移的挽救作用。

这篇文章的主要内容就是这些,让我们再来回顾一下整个研究。由于SMAD4的分子功能丧失与肿瘤密切相关,所以研究人员从该基因入手对122HNSCC肿瘤进行分析,首先评估该基因在肿瘤中突变和LOH的情况,探究其与临床分级、肿瘤大小以及预后的关系,发现有SMAD4突变或LOH的患者生存差,同时生存分析显示SMAD4低表达患者生存差。接下来又对SMAD4进行敲除以及对细胞系构建突变体,发现敲除会影响细胞迁移和入侵,而不同突变体对入侵和迁移的影响不同。

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