活性衰减型sgRNA文库实现基因表达的梯度式调控

生物学过程调控的复杂性在于,其不仅受表达的基因数量的调控,还收到基因表达的剂量影响。这其中最经典的实例便是单倍剂量不足效应,即部分基因表达水平的减半不足以维持正常的生理功能【1】。研究基因表达剂量与表型相关性的意义在于,可以了解维持正常生理功能所需要的特定基因的最低剂量,以更好的开展基因治疗或药物治疗;另一方面,探寻特定表型的剂量敏感型基因有助于发现新的药物靶点。目前研究者多采用不同类型的启动子,或是低活性突变在细菌和酵母中研究基因表达剂量与生物学表型的关系【2-6】。哺乳动物系统中,研究者的常用策略是,在内源基因中定向整合miRNA结合位点或是引入合成型启动子/调控子【7-8】。然而这类策略需要对内源基因进行改造,这极大的限制了其应用。近年来,TALEs(transcription activator-like effectors)技术及CRISPR技术的出现让基因表达的调控有了更多选择,其中CRISPR为基础的CRISPRi和CRISPRa,只需要特定的sgRNA,便可以有效的抑制/激活哺乳动物系统中特定基因的表达【9-10】。当然这类技术的不足之处在于,只能强力抑制/激活特定基因的表达,对基因表达的剂量缺乏梯度式调控。
2020年1月13日,来自加州大学旧金山分校(UCSF)细胞与分子药理学系的Jonathan S. Weissman实验室在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Titrating gene expression using libraries of systematically attenuated CRISPR guide RNAs的论文。文章通过构建活性衰减型的sgRNA文库实现了哺乳动物系统中基因表达的梯度式调控文章通过大规模检测含有不同错配位点的sgRNA的活性,借助于深度学习策略构建出可预测含有不同错配位点的sgRNA活性的模型。在此基础上研究者设计出活性衰减型的sgRNA文库,从而实现基因表达剂量的梯度式调控。这一策略对研究剂量依赖的细胞生物学过程及剂量-表型相关性有重要的意义。
首先,为了解含有不同错配位点的sgRNA在CRISPRi系统中的活性差异,研究者针对GFP基因的单一位点设计出57种包含有单一错配位点的sgRNA,并在K562细胞中对这一系列sgRNA的抑制活性进行比较,结果发现,错配位点靠近PAM区域的sgRNA活性衰减最明显,而错配位点远离PAM区域的sgRNA活性与无错配sgRNA活性相近。总体而言,不同错配位点的sgRNA可实现对GFP表达的梯度式抑制,提示我们错配式sgRNA库或可用于基因表达的梯度式调控。
不同的错配位点对sgRNA活性的影响是否有规律可循?为此,研究者针对影响细胞生长的2449种基因的4898种sgRNA位点设计衍生出包含12万条错配式sgRNA的文库。其设计思路是,每种sgRNA位点包含有一条无错配sgRNA和22-23条包含有1-2个错配位点的错配式sgRNA。而后研究者借助于CRISPRi系统在K562和Jurkat细胞中对文库进行筛选和分析,结果发现虽然绝大多数的错配式sgRNA均无活性,仍有约25%的错配式sgRNA保留有部分活性。为总结规律,研究者对中低活性的错配式sgRNA按照错配位点的特性进行分析,发现错配位点对dCas9蛋白结合能力的影响与错配式sgRNA的活性最为相关,这表明错配式sgRNA的活性主要由普遍的生物物理学规则所决定
除了在靶位点中引入错配突变调节sgRNA活性以构建错配式sgRNA文库,研究者还在sgRNA的恒定区引入突变,以探索其对sgRNA活性的影响。研究发现,部分恒定区的突变同样可以导致sgRNA活性的衰减从而实现基因表达剂量的梯度式调控。不过问题在于恒定区突变对sgRNA活性的影响并无明显的规律可循,因此难以进行预测,为此研究者专注于错配式sgRNA活性的预测和后续研究。
为更好的预测错配式sgRNA活性,研究者利用卷积神经网络(convolutional neural network,CNN)构建预测模型(图1),并在此基础上设计活性衰减型sgRNA文库开展后续的剂量-表型相关性研究。为能同时分析基因表达水平和细胞表型,研究者采用可在单细胞水平进行大规模基因型-表型筛选的方法Perturb-seq,借助于该方法,研究者可以在单细胞水平分析靶基因的剂量变化,同时研究该细胞的转录组特征,从而探究靶基因剂量与细胞表型的关系。研究发现部分基因表达的减少会明显抑制mRNA转录,这种抑制效应呈现出剂量的基因特异性:如GATA1 mRNA减半便会导致明显的抑制效果,而POLR2H mRNA要有更为显著的降低方有效果。
 
图1. CNN模型预测错配式sgRNA活性
总体而言,本研究首次系统性的分析了靶位点错配对sgRNA活性的影响,并借助于深度学习构建出预测错配式sgRNA活性的卷积神经网络(CNN)模型。在此基础上,研究者构建出了活性衰减型sgRNA文库,可以实现哺乳动物中基因表达的梯度式调控。这一策略对基因剂量效应的研究大有帮助,在此基础上,细胞生物学研究、药物研发乃至功能基因组学都将获益匪浅。
原文链接
https://doi.org/10.1038/s41587-019-0387-5

1. Huang, N., Lee, I., Marcotte, E. M. & Hurles, M. E. Characterizing and predicting haploinsufciency in the human genome. PLoS Genet. 6, e1001154 (2010)

2. Rest, J. S. et al. Nonlinear fitness consequences of variation in expression level of a eukaryotic gene. Mol. Biol. Evol. 30, 448–456 (2013).

3. Bauer, C. R., Li, S. & Siegal, M. L. Essential gene disruptions reveal complex relationships between phenotypic robustness, pleiotropy, and fitness. Mol. Syst. Biol. 11, 773–773 (2015).

4. Keren, L. et al. Massively parallel interrogation of the effects of gene expression levels on fitness. Cell 166, 1282–1294.e18 (2016).

5. Dekel, E. & Alon, U. Optimality and evolutionary tuning of the expression level of a protein. Nature 436, 588–592 (2005).

6. Alper, H., Fischer, C., Nevoigt, E. & Stephanopoulos, G. Tuning genetic control through promoter engineering. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 12678–12683 (2005).

7. Michaels, Y. S. et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nat. Commun. 10, 818 (2019).

8. Patwardhan, R. P. et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nat. Biotechnol. 27, 1173–1175 (2009)

9. Moore, R., Chandrahas, A. & Bleris, L. Transcription activator-like effectors: a toolkit for synthetic biology. ACS Synth. Biol. 3, 708–716 (2014).

10. Dominguez, A. A., Lim, W. A. & Qi, L. S. Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 5–15 (2016).

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